蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)是生命科學(xué)研究中極為重要的信息，X射線單晶衍射技術(shù)是目前獲得結(jié)構(gòu)信息最主要的手段，但如何篩選到第一個(gè)蛋白晶體是該技術(shù)必需的第一步，也是制約結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)展的主要瓶頸問(wèn)題之一?，F(xiàn)在一般通過(guò)規(guī)模篩選的方法從眾多的溶液中篩選出可結(jié)晶的條件，但是工作量較大，效率也不高?；仡櫫私陙?lái)在提高結(jié)晶篩選效率方向取得的成就，主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：一是在傳統(tǒng)結(jié)晶方法和試劑基礎(chǔ)土發(fā)展起來(lái)的一系列新的高效的結(jié)晶技術(shù)和篩選試劑盒；二是從生物學(xué)、物理學(xué)和化學(xué)等角度提出的一些提高結(jié)晶篩選效率的新技術(shù)，主要包括通過(guò)分子工程改造蛋白、提高蛋白溶液的穩(wěn)定和均一性、導(dǎo)入籽晶、共結(jié)晶、改善結(jié)晶界面和變溫篩選等技術(shù)。最后展望了該領(lǐng)域未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。
蛋白質(zhì)純化與結(jié)晶的原理
? ? ? ? 獲得蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)的第一個(gè)瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質(zhì)(>10 mg)，其濃度通常在10 mg/ml 以上，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選。運(yùn)用重組基因的技術(shù)，將特定基因以選殖(clone)的方式嵌入表現(xiàn)載體(expression vector)內(nèi)，此一載體通常具有易于調(diào)控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長(zhǎng)的菌體中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，在菌體快速生長(zhǎng)的同時(shí)，也大量生產(chǎn)表現(xiàn)載體上的基因所解譯出之蛋白質(zhì)。一般而言純度越高的蛋白質(zhì)比較有機(jī)會(huì)形成晶體，因此純化蛋白質(zhì)的步驟就成為一個(gè)重要的決定因素。
蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)
? ? ? ? 在取得高純度的蛋白質(zhì)溶液后，接下來(lái)就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質(zhì)晶體與其他化合物晶體的形成類(lèi)似，是在飽和溶液中慢慢產(chǎn)生的，每一種蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學(xué)上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類(lèi)、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度等；物理上的變數(shù)，如溶液達(dá)成過(guò)飽和狀態(tài)的速率、溫度等；及生化上的變數(shù)，如蛋白質(zhì)所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)、等電點(diǎn)等，皆是養(yǎng)晶時(shí)的測(cè)試條件。截至目前為止，并無(wú)一套理論可以預(yù)測(cè)結(jié)晶的條件，所以必須不斷測(cè)試各種養(yǎng)晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體(圖一) 。
? ? ? ?理論告訴我們，最好的晶體生長(zhǎng)要減少過(guò)飽和度到一個(gè)低的水平；維持高飽和度可能導(dǎo)致過(guò)多晶核的形成，從而產(chǎn)生很多小晶體（如圖1.1）。同時(shí)，晶體需要緩慢地生長(zhǎng)以在表面達(dá)到一個(gè)最高的有序度。然而實(shí)際中，并沒(méi)有遵從這個(gè)基本規(guī)則。最簡(jiǎn)單的改變過(guò)飽和度的方式是改變溫度或沉淀劑的濃度。
蛋白質(zhì)沉淀可以通過(guò)添加鹽、聚乙二醇或有機(jī)溶劑。作為沉淀劑，鹽有雙重作用，即鹽析和鹽溶。鹽離子屏蔽了蛋白質(zhì)分子表面的電荷，因此從而減弱了分子間的排斥力。此外，部分水被固定從而不可與蛋白質(zhì)結(jié)合，因?yàn)辂}離子周?chē)纬伤瘜?。最常用的鹽是硫酸銨，其優(yōu)點(diǎn)是溶解性好，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)無(wú)損害，即使?jié)舛群芨摺?/p>
聚乙二醇對(duì)水有高親和性，能像鹽那樣固定水。而且，它以不同的方式影響蛋白質(zhì)的溶解度。PEG分子不能超過(guò)其半徑而更接近蛋白質(zhì)分子表面，蛋白質(zhì)分子周?chē)蠵EG中心不能接近的水化層。如果蛋白質(zhì)分子聚集，這些水化層部分重疊，從而不可接近的區(qū)域變小。結(jié)果，可接近區(qū)域變大。從而有更多的空間對(duì)PEG分子可用，它們的熵增加（以一些蛋白質(zhì)熵為代價(jià)），系統(tǒng)的自由能降低。因此，蛋白質(zhì)分子聚集的這種情況在使用PEG時(shí)是最有利的。
蛋白質(zhì)結(jié)晶中最普遍的有機(jī)溶劑是MPD。有機(jī)溶劑具有靜電效應(yīng)，它們能降低介質(zhì)的的介電常數(shù)。靜電力變強(qiáng)，從而壓縮蛋白質(zhì)分子周?chē)x子的雙電層。這些分子可以彼此更加接近，如果在一個(gè)有利的方向，它們便可以聚集。
一些蛋白質(zhì)在水中溶解度不好，但是如果加入少量鹽（比鹽析少的多）就可溶解。移除鹽后，蛋白質(zhì)便會(huì)析出。這種鹽溶效應(yīng)可以解釋為蛋白質(zhì)分子表面帶電基團(tuán)和溶液中離子相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。在有溶劑離子時(shí)，蛋白質(zhì)分子不會(huì)被離子雙層包圍，而能通過(guò)不同蛋白質(zhì)分子上異種電荷之間的庫(kù)侖力相互聚集。如果少量離子被加入，蛋白質(zhì)周?chē)鷷?huì)形成離子雙層，它們彼此之間不擴(kuò)散不排斥。
其他降低蛋白質(zhì)溶解度的方法有改變?nèi)芤簆H或溫度。
綜上所述，通常結(jié)晶蛋白質(zhì)的步驟如下：
- 仔細(xì)檢測(cè)純度。
- a.慢慢增加沉淀劑的濃度，如PEG、鹽或有機(jī)溶劑等。
b.改變pH或溫度。
實(shí)際中，通常可用作結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)的量非常少。要確定最好的結(jié)晶條件，經(jīng)常需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)。因此，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該用最少量的蛋白質(zhì)。一個(gè)合理大小(0.2×0.2×0.2mm?=0.008mm3)的蛋白質(zhì)晶體重約10μg。因此，1mg純化的蛋白質(zhì)可以足夠做大約100次結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。
膜蛋白在水中不溶解，因此很難結(jié)晶。通常的策略是使用洗滌劑將其溶解于水溶液中，然后采用水溶性蛋白的操作程序(Michel,1990; Sowadski, 1994)。Landau和Rosenbusch（1996）引進(jìn)一種新的方法能夠結(jié)晶膜蛋白。他們采用脂立方相作為各種化合物結(jié)晶的母體，脂立方相是具有立體對(duì)稱性的液晶，它們能在脂和水的混合物中形成(Lindblom and Rilfors, 1989)。一些類(lèi)型的脂立方相是存在的。Landau等人（1997）成功地在某一類(lèi)型脂立方相中生長(zhǎng)出了高度有序的細(xì)菌視紫紅質(zhì)（bacteriorhodopsin）膜蛋白晶體(see also Gouaux, 1998)。但仍要看是否這種方法在結(jié)晶更多膜蛋白中取得成功。
? ? ? ? ?蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)，通常是利用氣相擴(kuò)散法(Vapor Diffusion Method) 的原理來(lái)達(dá)成；也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)(10-50 mg/ml)溶液加入適當(dāng)?shù)娜軇?，慢慢降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來(lái)說(shuō)，我們將蛋白質(zhì)溶于低濃度(~1.0 M) 的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度(~2.0 M)硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨的濃度，進(jìn)而達(dá)成結(jié)晶的目的(圖二)。
? ? ? ?蛋白質(zhì)晶體在外觀上與其他晶體并無(wú)明顯不同之處，但在晶體的內(nèi)部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質(zhì)晶體除了蛋白質(zhì)分子外，其他的空間則充滿約40 %至60 %之間的水溶液，其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質(zhì)分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成晶體處理時(shí)的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點(diǎn)。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質(zhì)分子在晶體內(nèi)與水溶液中的狀態(tài)，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，基本上可視為自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。
? ? ? ? ?蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法簡(jiǎn)介 到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。近年來(lái)還出現(xiàn)了一種新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射線的方法產(chǎn)生的更早，也更加的成熟，解析的數(shù)量也更多，我們知道，第一個(gè)解析的蛋白的結(jié)構(gòu)，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發(fā)展起來(lái)的。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
蛋白質(zhì)結(jié)晶原理（Principles of Protein Crystallization）
蛋白質(zhì)的X射線結(jié)構(gòu)分析首先要獲得合適的單晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)尚未發(fā)展成熟，盡管很受人親睞，特別是受航天飛機(jī)中微重力實(shí)驗(yàn)(Kundrot et al., 2001; McPherson et al., 1995)的激發(fā)。蛋白質(zhì)結(jié)晶是一個(gè)反復(fù)試驗(yàn)的過(guò)程，蛋白質(zhì)逐漸會(huì)從溶液中析出，雜質(zhì)、晶核及其他未知因素對(duì)此過(guò)程有所影響。通常，蛋白質(zhì)越純，生長(zhǎng)晶體幾率越大。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)者對(duì)蛋白質(zhì)的純度要求要嚴(yán)于生化學(xué)家的要求，后者往往在酶催化活性足夠高時(shí)就很滿意。另一方面，為了使蛋白質(zhì)結(jié)晶，不僅要加其他成分，所有蛋白質(zhì)分子的表面性質(zhì)也必須是相同的，特別是表面的電荷分布，因?yàn)樗绊懢w內(nèi)分子的聚集。質(zhì)譜是蛋白質(zhì)結(jié)晶中的一種有效工具，例如檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)、樣品純度、重原子衍生物及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性(Cohen, 1996; Potier et al.,2000)。
蛋白質(zhì)結(jié)晶涉及四個(gè)重要步驟如下：
- 蛋白質(zhì)純度的確定。如果不夠非常純，必須要進(jìn)一步純化。
- 蛋白質(zhì)溶解于合適的溶劑中，從中它能通過(guò)一種鹽或有機(jī)化合物而析出。溶劑通常是水-緩沖劑溶液，有時(shí)加有機(jī)溶劑，如2-甲基-2，4-戊二醇（MPD）。正常情況下，沉淀劑也被加入，但是濃度不高于使沉淀產(chǎn)生。對(duì)于不溶于水-緩沖劑或水-有機(jī)溶劑的膜蛋白，還需要加入去污劑。
- 使溶液過(guò)飽和。在這一步中，小聚集體形成，它是晶體生長(zhǎng)所需的核。對(duì)小分子的結(jié)晶來(lái)說(shuō)，相比于蛋白質(zhì)更為人熟知，晶核的自發(fā)形成需要提供表面張力能。一旦這個(gè)能障被突破了，晶體開(kāi)始生長(zhǎng)。能障在高水平的過(guò)飽和度時(shí)很容易克服。因此，在高過(guò)飽和度時(shí)，晶核更易自發(fā)形成。晶核的形成可作為一個(gè)過(guò)飽和度和其他參數(shù)的函數(shù)通過(guò)多種方法來(lái)研究，包括光散射、熒光去極化及電子顯微鏡。
- 一旦晶核形成，晶體生長(zhǎng)正式開(kāi)始。對(duì)低分子量的化合物而言，新分子會(huì)逐步結(jié)合到正在生長(zhǎng)的晶體表面。這是由于這些位置的結(jié)合能比較大，相對(duì)于分子結(jié)合到平滑的表面。這些步驟要么由晶系缺陷造成，要么發(fā)生在表面隨機(jī)形成的晶核。
蛋白質(zhì)結(jié)晶方法大總結(jié)?
1.1結(jié)晶方法(Crystallization Techniques)
1.1.1 分批結(jié)晶(Batch Crystallization) 這是最老的最簡(jiǎn)單的結(jié)晶方法，其原理是同步地在蛋白質(zhì)溶液中加入沉淀劑，立即使溶液達(dá)到一個(gè)高過(guò)飽和狀態(tài)。幸運(yùn)的話，不需進(jìn)一步處理即可在過(guò)飽和溶液中逐漸長(zhǎng)出晶體。一個(gè)用于微分批結(jié)晶的自動(dòng)化系統(tǒng)已被Chayen等人設(shè)計(jì)出（1991，1992），其微分批方法中，他們?cè)?-2μl包含蛋白質(zhì)和沉淀劑的液滴中生長(zhǎng)晶體。液滴被懸浮在油（如石蠟）中，油的作用是作為封層以防止蒸發(fā)，它并不干擾普通沉淀劑，但是干擾能溶解油的有機(jī)溶劑(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。
1.1.2 液-液擴(kuò)散(Liquid–Liquid Diffusion) 這種方法中，蛋白質(zhì)溶液和含有沉淀劑的溶液是彼此分層在一個(gè)有小孔的毛細(xì)管中，一個(gè)測(cè)熔點(diǎn)用的毛細(xì)管一般即可（如圖1.2）。下層是密度大的溶液，例如濃硫酸銨或PEG溶液。如果有機(jī)溶劑如MPD被用作沉淀劑，它會(huì)在上層。以1：1混合，沉淀劑的濃度應(yīng)該是所期最終濃度的二倍。兩種溶液（各自約5μl）通過(guò)注射器針頭導(dǎo)入毛細(xì)管，先導(dǎo)入下層的。通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)易的搖擺式離心機(jī)去除氣泡。再加入上層，進(jìn)而兩層之間形成一個(gè)明顯的界面，它們會(huì)逐漸彼此擴(kuò)散。 Garc′?a-Ruiz and Moreno（1994）已經(jīng)發(fā)展液-液擴(kuò)散技術(shù)至針刺法。蛋白質(zhì)溶液通過(guò)毛細(xì)力被吸入狹窄的管中，管的一端是封閉的。接著，開(kāi)放端被插入置于小容器的凝膠中，凝膠使得管豎直，蛋白質(zhì)溶液與凝膠接觸。含有沉淀劑的溶液被倒在凝膠上，整個(gè)裝置被保存于封閉的盒子以防蒸發(fā)。沉淀劑通過(guò)凝膠和毛細(xì)管的擴(kuò)散時(shí)間可以由毛細(xì)管插入凝膠的深度控制，從而蛋白質(zhì)溶液中即可形成過(guò)飽和區(qū)域，毛細(xì)管底部高而頂部低。這也可作為一個(gè)篩選佳結(jié)晶條件的額外信息。
1.1.3 蒸氣擴(kuò)散（Vapor Diffusion）
1.1.3.1 懸滴法（The Hanging Drop Method）這種方法中，在一個(gè)硅化的顯微鏡蓋玻片上通過(guò)混合3-10μl蛋白質(zhì)溶液和等量的沉淀劑溶液來(lái)制備液滴。蓋玻片置于一個(gè)盤(pán)子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀劑溶液約1ml。在蓋玻片放好之前，小室的凹槽周?chē)糜突蛴椭芊猓ㄈ鐖D3）。
1.1.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在懸滴法中，如果蛋白質(zhì)溶液表面張力很小就會(huì)在蓋玻片表面展開(kāi)。此時(shí)，沉滴法更有利，圖4給出了沉滴法的簡(jiǎn)圖。
1.1.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，還有許多透析技術(shù)。透析的優(yōu)點(diǎn)是沉淀溶液容易改變，對(duì)于適量的蛋白質(zhì)溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如圖1.5a）。透析膜通過(guò)橡皮圈連在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮約10min。對(duì)微升量的蛋白質(zhì)溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛細(xì)管（Zeppezauer method）或者樹(shù)脂玻璃紐扣（如圖1.5b）。紐扣的缺點(diǎn)是紐扣中的蛋白質(zhì)晶體不能通過(guò)極化顯微鏡觀察到。
另一中微透析方法在圖1.6中有描述，將5μl蛋白質(zhì)溶液注射到一個(gè)毛細(xì)管中，毛細(xì)管覆有透析膜，膜可用塑料管套緊。對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行簡(jiǎn)單離心，然后用鑄模粘土將毛細(xì)管封閉，接著將毛細(xì)管放入含有透析液的Eppendorf管中。