Megazyme 總淀粉檢測試劑盒K-TSTA說明書
簡介:
酸水解法和酶法被廣泛的應(yīng)用于淀粉含量測定,酸水解法僅僅適用于純凈的淀粉樣品,應(yīng)用范圍有限。酶法的前處理步驟上有各種變化，經(jīng)過凝膠、液化和糊精化作用,糊精水解生成葡萄糖,最終以測量的葡萄糖計算淀粉含量。AACC方法76-11特殊之處在于：在高壓蒸汽和堿性環(huán)境下淀粉糊化成為凝膠，然后再用淀粉葡糖苷酶將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖進行測量。AACC方法76-11會低估某些樣品的淀粉含量，包括高多糖玉米淀粉和眾多的經(jīng)過加工的谷物產(chǎn)品。今天應(yīng)用的眾多的測定方法都使用了聯(lián)合處理方法,如在樣品處理過程中或直接在淀粉凝膠化后使用耐熱α-淀粉酶。對于難凝膠的樣品(如高多糖玉米淀粉)使用了氫氧化鈉或二甲基亞砜作為溶劑。為確保膳食纖維中的淀粉能夠全部溶解，Englyst和Cummings(1988)總結(jié)的處理方法中使用了去分支酶,支鏈淀粉酶。
為了測量極端樣品得到滿意結(jié)果，兼顧數(shù)量和可靠性，Megazyme提供了一個總淀粉分析試劑盒，基于使用耐熱性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。這一方法已被AOAC和AACC采用?(Method?76.13)。
最近，耐熱淀粉酶可在低pH環(huán)境下使用。因此，我們更新了我們的總淀粉測量方法加入了這種酶。這一改進的最大益處在于可以在同一pH（pH5.0）條件下進行耐熱性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶孵育，簡化步驟以及減少麥芽酮糖（抗耐熱性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解）的產(chǎn)生。另一改進是使用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶/?NADP+在D-葡萄糖處理步驟(K-TSHK5)。Megazyme總淀粉分析方法可以測量廣泛范圍內(nèi)食品，飼料，植物和谷類產(chǎn)品（自然的或加工的）。對于大多數(shù)樣品（例如小麥面粉），淀粉可以在100°C抗耐熱性淀粉酶處理步驟中完全可溶。包含高水平抗性淀粉（例如高多糖含量玉米淀粉）樣品，需要先用冷2?M?KOH?或?熱DMSO進行預(yù)溶解。含可溶性淀粉和糊精的樣品，無需進行抗耐熱性淀粉酶處理。
原理:
抗耐熱性淀粉酶水解淀粉為可溶性分支麥芽糊精和去分支麥芽糊精。
樣品中的抗性淀粉可用2M?KOH進行預(yù)溶解，再用醋酸鈉緩沖液進行中和再進行淀粉酶水解。或者用DMSO在100°C進行溶解。
淀粉葡萄糖苷酶水解麥芽糊精至D-葡萄糖。
D-葡萄糖氧化為D-葡萄糖酸脂，釋放出(H2O2)，再用過氧化氫酶催化進行顯色反應(yīng)，產(chǎn)生醌亞胺染料。
樣品包含高水平的D-葡萄糖和麥芽糊精可以在分析前用80%乙醇進行洗滌。單個樣品可在70分鐘內(nèi)完成測定。20個樣品可在2小時內(nèi)完成。
特異性，靈敏度，線性范圍和精確性
此試劑盒專用于分析a-葡聚糖（包括淀粉，糖原，植物糖原和非抗性麥芽糊精）。
最小可區(qū)分的吸收值是0.01吸收值范圍。這對應(yīng)于1.0mg的D-葡萄糖（或0.9mg淀粉）/L在最大樣品體積1ml。檢測極限：2.0mgD-葡萄糖（或1.8mg淀粉）/L，這對應(yīng)于0.02吸光度區(qū)別在最大體積1ml中。
此試劑盒在5-100ugD-葡萄糖范圍內(nèi)呈線性。一個樣品溶液的重復(fù)測定中，吸收值會有0.005至0.010的波動。當(dāng)樣品體積為1ml時，這相當(dāng)于0.05-1ml/L濃度的D-葡萄糖。如果樣品在準(zhǔn)備過程中被稀釋，結(jié)果需要乘以稀釋倍數(shù)。例如在樣品準(zhǔn)備時，樣品稱重，如10g/L，變異范圍將在0.02至0.05g/100g。
干擾:
如果D-葡萄糖的轉(zhuǎn)化在5分鐘內(nèi)完成，不會產(chǎn)生干擾?？梢酝ㄟ^加入D-葡萄糖至反應(yīng)完成后試管內(nèi)（例如50ug在0.1ml）以檢測干擾?？梢钥吹轿舛蕊@著上升。
樣品內(nèi)的干擾物質(zhì)可以通過加入內(nèi)標(biāo)進行分析。可以對這標(biāo)準(zhǔn)進行定量校正。樣品操作中的損失可以通過在起始步驟中加入D-葡萄糖進行校正。
試劑盒成分
Megazyme總淀粉含量測定試劑盒提供有足夠運行100次試驗的試劑,并提供有全部的試驗方法:
瓶1:?耐熱α-淀粉酶(10mL,?3,000U/mL在CERALPHA試劑中pH6.5;?40°C?或1600U/mL在CERALPHA試劑中pH5.0;?40°C)。穩(wěn)定性>4年,?4°C保存。
瓶2:?淀粉葡糖苷酶(10mL,?3300U/mL在可溶性淀粉)（或200U/mL在p-nitrophenylβ-maltoside*，pH4.5，40°C）穩(wěn)定性>4年,?4°C保存。
完整的分析程序可在www.megazyme.com獲得。
瓶3:?GOPOD試劑緩沖液。磷酸鉀緩沖液（0.26M，pH7.4），對羥基苯甲酸（0.22M），疊氮化鈉（0.4%W/V）穩(wěn)定性>4年,?4°C保存。
注意：
- 如果GOPOD緩沖液存儲在-20°C，會形成鹽結(jié)晶，用雙蒸水稀釋至1L前必須完成溶解。
- 此溶液含疊氮化鈉（0.4%W/V），有毒。
瓶4:?GOPOD試劑酶。葡萄糖氧化酶(>?12,000?U)?和過氧化物酶(>?650?U)和4-氨基安替比林（80mg）。凍干粉，穩(wěn)定性>4年,?-20°C保存。
瓶5:?葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5ml，1mg/mL）在0.2%?W/V苯甲酸溶液中。穩(wěn)定性>4年，室溫保存。
瓶6:?標(biāo)準(zhǔn)的玉米淀粉。淀粉含量見標(biāo)簽。穩(wěn)定性>4年,?-20°C保存。
準(zhǔn)備試劑溶液
溶液1??用試劑1（100mM醋酸鈉緩沖液,?pH5.0，自備）稀釋1.0mL瓶1成分至30mL?。分成小份后凍存。穩(wěn)定性>3年,?-20°C保存。
注意：如果按照AOAC方法996.11（example?b），用試劑4（50mM?MOPS緩沖液,pH7.0）稀釋酶。
溶液2??此酶不用稀釋可以直接使用,由于酶溶液具有一定粘稠度,所以必須使用正確的移液器。4°C下保存,穩(wěn)定性>3年。
溶液3??用蒸餾水稀釋瓶3成分（GOPOD試劑緩沖液）到1L,?立即使用。
溶液4?用20ml溶液3溶解瓶4成分再倒回溶液3瓶子。鋁箔紙包裹避光。這就是???????? 葡萄糖測定試劑(GOPOD試劑)?穩(wěn)定性:?4°C下保存，3個月；-20°C下保存，???????????? 12個月；
分裝成小份再進行凍存，只能凍融一次。
新鮮配制的試劑呈淺黃色或淺紫色。4°C下保存2-3個月過程中，逐漸變成深紫色。用水為空白對照時，此溶液的吸光度<0.05。
溶液5&6?同瓶5&6
自備試劑
1.醋酸鈉緩沖液(100mM,?pH5.0)?+氯化鈣(5mM)?
5.8ml冰醋酸(1.05g/mL)加入900mL蒸餾水,用1M(4g/100mL)NaOH調(diào)節(jié)pH到5.0,大約需要30mL。4°C下保存2個月.
添加0.74g二水氯化鈣完全溶解,?定容到1L,??4°C下保存>6個月。
注意：可通過添加疊氮化鈉（0.2g/L）增加此緩沖液的穩(wěn)定性。室溫2年。必須在pH調(diào)完后再加入疊氮化鈉。酸化的疊氮化鈉會釋放出有毒氣體。
2.醋酸鈉緩沖液(1.2M,?pH3.8)?
69.6ml冰醋酸(1.05g/mL)加入800mL蒸餾水,?用4M?NaOH調(diào)節(jié)pH到3.8,?定容到1L。室溫下保存12個月。
3.氫氧化鉀溶液（2M）
加入112.2?g?KOH?至900?mL?去離子水，攪拌溶解，定容一升。儲存于密閉容器。室溫下>2年。
- MOPS緩沖液(50mM,pH7.0)+氯化鈣(5mM)?+疊氮化鈉(0.02%)（僅用于example?b分析樣品）
11.55g?MOPS(鈉鹽,?Sigma?cat.?M-9381)加入900mL蒸餾水,?用1M(10%V/V)HCl調(diào)節(jié)pH到7.0,大約需要17mL。?添加二水氯化鈣(0.74g)和疊氮化鈉(0.2g),?完全溶解,?然后調(diào)整到1L,?4°C下保存6個月。
- 醋酸鈉緩沖液(200mM,pH4.5)+疊氮化鈉(0.02%)（僅用于example?b分析樣品）
冰醋酸(11.8mL,1.05g/mL)加入900mL蒸餾水,?用1M(4g/100mL)NaOH調(diào)節(jié)pH到4.5,大約需要60mL。加入疊氮化鈉(0.2g),完全溶解,然后調(diào)整到1L,?4°C下保存6個月。
注意：可通過添加疊氮化鈉（0.2g/L）增加此緩沖液的穩(wěn)定性。室溫2年。必須在pH調(diào)完后再加入疊氮化鈉。酸化的疊氮化鈉會釋放出有毒氣體。
設(shè)備:
1.玻璃試管(圓底;16x120mm或18x150mm)
2.離心機(3,000rpm)
3.微量移液器(100uL).
4.連續(xù)分配器
5.分析天平.
6.分光光度計510nm.
7.漩渦混合器
8.定時鐘
9.沸水浴鍋和試管夾
注意事項:
1.GOPOD試劑的孵育時間沒有嚴格規(guī)定,但是至少要20分鐘,并在60分鐘內(nèi)測定吸光度.
2.每次試驗必須設(shè)定試劑空白對照和葡萄糖對照(100μg,?四倍)。
a)試劑空白對照:?0.1mL蒸餾水+3.0mLGOPOD溶液
b)葡萄糖對照包括:0.1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/0.1mL)+3.0mLGOPOD溶液。因子F（頁碼13和14）通過D-葡萄糖在標(biāo)準(zhǔn)分析中讀得的吸光度進行計算（例如100/1.038=96.386）。
3.每次試驗必須設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)面粉或淀粉樣品
4.每一新批此的GOPOD溶液,必須驗證其與100μg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)產(chǎn)生顏色所需要的最長時間,?通常為15分鐘左右。
樣品空白:
樣品空白按照標(biāo)準(zhǔn)試驗程序（example?A）進行,將第4步修正為添加3mL蒸餾水,第5步中也用蒸餾水替代其中的淀粉葡糖苷酶.也可以用樣品前處理中所用的酒精作為樣品空白(?example?E)。
樣品準(zhǔn)備示例
A.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麥芽糊精的谷物和食物（建議的程序，pH5.0孵育）。
1.研磨谷物,?過0.5mm篩（35目）。
2.將研磨后樣品(準(zhǔn)確稱量~100mg)加入到試管中(16x120mm),確保全部樣品位于試管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v)濕潤樣品幫助分散,?用漩渦混合器混合。
4.立即加入3mL耐熱α-淀粉酶(100mM醋酸鈉稀釋),?在沸水浴中孵育6分鐘(在孵育2分鐘,4分鐘，6分鐘的時強烈振蕩試管).
注意:在這一步中強力震蕩是關(guān)鍵，目的是確保漿狀樣品能完全的混勻（去除塊狀）。同樣,每間隔2分鐘振蕩也是為了防止由于酒精蒸發(fā)導(dǎo)致某些樣品被噴出試管。如果使用聚丙烯管，增加孵育時間至12分鐘，在?4,?8和12強烈震蕩。
5.將試管放置于50°C的水浴鍋中,?加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶,330U在淀粉上）。充分混合,在50°C下孵育30分鐘。
6.將全部的溶液轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中,用洗瓶沖洗試管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸餾水調(diào)整溶液體積,?充分混勻。取部分溶液離心(3,000rpm,10分鐘)。取清澈的未稀釋的上清用于分析。
注意：對于含有1-10%淀粉的樣品,在第6步中用蒸餾水調(diào)整溶液至10mL,充分混勻,離心(3,000rpm,10分鐘),該溶液可以直接進行第7步.對于含10-100%淀粉的樣品,用蒸餾水稀釋1.0mL樣品液到10mL再進行第7步。
7.轉(zhuǎn)移兩份稀釋的樣品溶液(0.1mL)到園底試管中(16x100mm)。
8.加入3.0mLGOPOD溶液到每一個試管中(包括葡萄糖對照和試劑空白對照),?然后在50°C下孵育20分鐘
9.葡萄糖對照包括0.1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/mL)+3.0mLGOPOD溶液。???????????? 試劑空白對照:?0.1mL蒸餾水+3.0mLGOPOD溶液
10.相對于試劑空白在510nm下測定每一個樣品和葡萄糖質(zhì)控的吸光度。
B.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麥芽糊精的谷物和食物（AOAC?996.11）。
1.研磨谷物,?過0.5mm篩（35目）。
2.將研磨后樣品(準(zhǔn)確稱量~100mg)加入到試管中(16x120mm),確保全部樣品位于試管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩渦混合器混合。
4.立即加入3mL耐熱α-淀粉酶(50mM?MOPS稀釋),?在沸水浴中孵育6分鐘(在孵育2分鐘,4分鐘，6分鐘的時強烈振蕩試管).
注意:在這一步中強力震蕩是關(guān)鍵，目的是確保漿狀樣品能完全的混勻（去除塊狀）。同樣,每間隔2分鐘振蕩也是為了防止由于酒精蒸發(fā)導(dǎo)致某些樣品被噴出試管。如果使用聚丙烯管，增加孵育時間至12分鐘，在?4,?8和12強烈震蕩。
5.將試管放置于50°C的水浴鍋中,?加入醋酸鈉緩沖液（4ml，200mM，pH4.5），加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶,?20U）。充分混合,在50°C下孵育30分鐘。
- 按照example?A?步驟6繼續(xù)實驗。
C.含抗性淀粉，不含D-葡萄糖和麥芽糊精的谷物和食物（建議KOH溶解）
1.研磨谷物,?過0.5mm篩（35目）。
2.將研磨后樣品(準(zhǔn)確稱量~100mg)加入到試管中(16x120mm),確保全部樣品位于試管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩渦混合器混合。
4.放入攪拌架子，加入2ml?2M?KOH至每個試管中，冰水混合浴中攪拌20分鐘左右，重懸粉末和溶解抗性淀粉。
注意：
1.不要使用渦旋儀混勻，會使淀粉乳化。
2.確保加入KOH時，試管處于劇烈震蕩狀態(tài)。這是為了避免淀粉形成團塊難以溶解。
5.當(dāng)試管在磁力攪拌器上攪拌時，加入8ml?1.2M醋酸鈉緩沖液（pH3.8）至每個試管。立即加入0.1ml耐熱α-淀粉酶（瓶1）和0.1mL淀粉葡糖苷酶（瓶2），充分混合,在50°C下孵育
- 孵育30分鐘，間斷混勻。
- 樣品淀粉含量>10%：將全部的溶液轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中,用洗瓶沖洗試管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸餾水調(diào)整溶液體積至100ml,?充分混勻。取部分溶液離心(1800g,10分鐘)。
- 樣品淀粉含量<10%：直接離心(1800g,10分鐘)?？傮w積約10.4ml（此體積可能有一定波動，特別是濕樣品用于分析時，估計體積用于計算）。
- 按照example?A?步驟7繼續(xù)實驗。
D.含抗性淀粉，不含D-葡萄糖和麥芽糊精的谷物和食物（AOAC?996.11?DMSO溶解）
1.研磨谷物,?過0.5mm篩（35目）。
2.將研磨后樣品(準(zhǔn)確稱量~100mg)加入到試管中(16x120mm),確保全部樣品位于試管底部。
3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩渦混合器混合。
4.立即加入2ml?DMSO，渦旋混勻。沸水浴5分鐘。
5.按照example?A?步驟4繼續(xù)實驗。
E.含D-葡萄糖和麥芽糊精的谷物和食物
1.研磨谷物,?過0.5mm篩（35目）。
2.將研磨后樣品(準(zhǔn)確稱量~100mg)加入到試管中(16x120mm),確保全部樣品位于試管底部。
3.加入5mL乙醇溶液(80%v/v)，80-85°C孵育5分鐘。渦旋混勻，再加入5ml乙醇溶液(80%v/v)。
4.離心1800g（3000rpm）10分鐘。去除上清。
5.10mL乙醇溶液(80%v/v)重懸沉淀。離心去除上清。
- 按照example?A?步驟4繼續(xù)實驗。
若樣品含抗性淀粉，按照example?C步驟4繼續(xù)實驗。
計算:
ΔA=相對于試劑空白所讀取的吸光度
FV=總體積（例如100ml或10ml）
0.1?=樣品分析體積
1/1000=轉(zhuǎn)化從ug至mg
100/w=淀粉作為干粉重量的比例。
W=干粉重量
162/180=D葡萄糖轉(zhuǎn)化為脫氫葡萄糖
淀粉%(占干物質(zhì)比重):＝淀粉%X100/100-水分含量(%)