蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè)方法總結(jié)和資料匯總
“折疊（fold）”的概念

“折疊（fold）”是近年來(lái)蛋白質(zhì)研究中應(yīng)用較廣的一個(gè)概念，它是介與二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次，它描述的是二級(jí)結(jié)構(gòu)元素的混合組合方式。

二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)方法介紹：

Chou-Fasman算法：

是單序列預(yù)測(cè)方法中的一種，它是使用氨基酸物理化學(xué)數(shù)據(jù)中派生出來(lái)的規(guī)律來(lái)預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。 首先統(tǒng)計(jì)出20種氨基酸出現(xiàn)在α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲中出現(xiàn)頻率的大小，然后計(jì)算出每一種氨基酸在這幾種構(gòu)象中的構(gòu)象參數(shù)Px.構(gòu)象參數(shù)值的大小反映了該種殘基出現(xiàn)在某種構(gòu)象中的傾向性的大小。按照構(gòu)象參數(shù)值的大小可以把氨基酸分為六個(gè)組：Ha（強(qiáng)螺旋形成者）、ha（ 螺旋形成者）、Ia（弱螺旋形成者）、ia（螺旋形成不敏感者）、ba（螺旋中斷者）、Ba（強(qiáng)螺旋中斷者）。Chou和Fasman根據(jù)殘基的傾向性因子提出二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則，要點(diǎn)是沿蛋白序列尋找二級(jí)結(jié)構(gòu)的成核位點(diǎn)和終止位點(diǎn)。這種方法可能能夠正確反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程，但預(yù)測(cè)成功率并不高，僅有50%左右

GOR算法：

也是單序列預(yù)測(cè)方法中的一種，因其作者Garnier, Osguthorpe和 Robson而得名。這種方法是以信息論為基礎(chǔ)的，也屬于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的一種，GOR方法不僅考慮被預(yù)測(cè)位置本身氨基酸殘基種類對(duì)該位置構(gòu)象的影響，也考慮到相鄰殘基種類對(duì)該位置構(gòu)象的影響。這樣使預(yù)測(cè)的成功率提高到 65% 左右。GOR方法的優(yōu)點(diǎn)是物理意義清楚明確，數(shù)學(xué)表達(dá)嚴(yán)格，而且很容易寫出相應(yīng)的計(jì)算機(jī)程序，但缺點(diǎn)是表達(dá)式復(fù)雜。

多序列列線預(yù)測(cè)：

對(duì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用多序列比對(duì)的信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。調(diào)查者可找到和未知序列相似的序列家族，然后假設(shè)序列家族中的同源區(qū)有同樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)不是基于一個(gè)序列而是一組序列中的所有序列的一致序列。

基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的序列預(yù)測(cè)：

利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法進(jìn)行序列的預(yù)測(cè)，BP (Back-Propagation Network) 網(wǎng)絡(luò)即反饋式神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法是目前二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用最廣的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，它通常是由三層相同的神經(jīng)元構(gòu)成的層狀網(wǎng)絡(luò)，使用反饋式學(xué)習(xí)規(guī)則，底層為輸入層，中間為隱含層，頂層是輸出層，信號(hào)在相鄰各層間逐層傳遞，不相鄰的各層間無(wú)聯(lián)系，在學(xué)習(xí)過(guò)程中根據(jù)輸入的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系的信息不斷調(diào)整各單元之間的權(quán)重，最終目標(biāo)是找到一種好的輸入與輸出的映象，并對(duì)未知二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用方便，獲得結(jié)果較快較好，主要缺點(diǎn)是沒(méi)有反映蛋白的物理和化學(xué)特性，而且利用大量的可調(diào)參數(shù)，使結(jié)果不易理解。許多預(yù)測(cè)程序如PHD、PSIPRED等均結(jié)合利用了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算方法。

基于已有知識(shí)的預(yù)測(cè)方法（knowledge based method）:

這類預(yù)測(cè)方法包括Lim 和 Cohen 兩種方法。Lim 方法是一種物理化學(xué)的方法，它根據(jù)氨基酸殘基的物理化學(xué)性質(zhì)，包括：疏水性、親水性、帶電性以及體積大小等，并考慮殘基之間的相互作用而制訂出一套預(yù)測(cè)規(guī)則。對(duì)于小于50個(gè)氨基酸殘基的肽鏈， Lim 方法的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率可以達(dá)到73%. 另一種是 Cohen 方法，它的提出當(dāng)時(shí)是為了α/β蛋白的預(yù)測(cè)，基本原理是說(shuō)：疏水性殘基決定了二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)位置，螺旋亞單元或擴(kuò)展單元是結(jié)構(gòu)域的核心，α螺旋和β折疊組成了結(jié)構(gòu)域。

混合方法（hybrid system method）:

將以上幾種方法選擇性的混合使用，并調(diào)整他們之間使用的權(quán)重可以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率，目前預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率在70%以上的都是混合方法，其中，同源性比較方法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法 和 GOR方法 應(yīng)用最為廣泛。

三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)：

同源性建模：

假設(shè)對(duì)已知結(jié)構(gòu)的另一個(gè)蛋白質(zhì)序列來(lái)排列一個(gè)蛋白質(zhì)的序列，如果靶序列和已知結(jié)構(gòu)序列在整個(gè)序列的全長(zhǎng)有很高的相似性，在合理的信任度上，我們可以使用已知結(jié)構(gòu)作為靶蛋白質(zhì)的模版。

“串線（threading）”算法：

串線結(jié)構(gòu)分析是試圖把未知的氨基酸序列和各種已存在的三維結(jié)構(gòu)相匹配，并評(píng)估序列折疊成那種結(jié)構(gòu)的合適度。串線法最適用于折疊（fold）的識(shí)別，而不是模型的建立。它是快速用未知序列的氨基酸側(cè)鏈替換已知序列中的氨基酸位置。Jones等首先從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建立折疊子數(shù)據(jù)庫(kù)，以折疊子數(shù)據(jù)庫(kù)中的折疊結(jié)構(gòu)作為模板，將目標(biāo)序列與這些模板一一匹配，通過(guò)計(jì)算打分函數(shù)值判斷匹配程度，根據(jù)打分值給模板結(jié)構(gòu)排序，其中打分最高的被認(rèn)為是目標(biāo)序列最可能采取的折疊結(jié)構(gòu)。Threading 方法的難點(diǎn)在于序列與折疊結(jié)構(gòu)的匹配技術(shù)和打分函數(shù)的確定。（Jones等，1992）

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)通常被認(rèn)為是蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的第一步，是根據(jù)它們被預(yù)測(cè)的局部結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白序列中的氨基酸進(jìn)行分類。二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)方法通常分為多序列列線預(yù)測(cè)和單序列預(yù)測(cè)的方法。由于單序列預(yù)測(cè)所提供的信息只是殘基的順序而沒(méi)有其空間分布的信息，所以單序列預(yù)測(cè)的算法預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率并不高而且對(duì)于一些特殊結(jié)構(gòu)，這些算法很難預(yù)測(cè)成功。 多序列列線預(yù)測(cè)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用大大提高了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，通過(guò)對(duì)序列比對(duì)的預(yù)測(cè)可以明確的提供單一位點(diǎn)在三維結(jié)構(gòu)上的信息。這樣通常二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率比單序列預(yù)測(cè)能夠提高１０%.許多方法據(jù)說(shuō)可達(dá)到70%-77%，目前較為常用的幾種方法有：PHD、PSIPRED、Jpred、PREDATOR、PSA。其中最常用的是PHD。PHD結(jié)合了許多神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的成果，每個(gè)結(jié)果都是根據(jù)局部序列上下文關(guān)系和整體蛋白質(zhì)性質(zhì)（蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、氨基酸頻率等）來(lái)預(yù)測(cè)殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)。那么，最終的預(yù)測(cè)是這些神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)每個(gè)輸出的算術(shù)平均值。 這種結(jié)合方案被稱為陪審團(tuán)決定法（jury decision）或者稱為所有勝利者（winner-take-all）法。PHD被認(rèn)為是二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)方法通常包括：同源性建模和從頭開(kāi)始的預(yù)測(cè)方法。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知結(jié)構(gòu)的序列的比對(duì)是預(yù)測(cè)未知序列三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要方法，也即同源建模的方法。通常對(duì)于同源建模的方法過(guò)程并非統(tǒng)一，但基本思路是一致的，基本包括如下幾個(gè)步驟：
1．使用未知序列作為查詢來(lái)搜索已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
2．產(chǎn)生未知序列和模版序列最可能的完整比對(duì)。
3．以模版結(jié)構(gòu)骨架作為模型，建立蛋白質(zhì)骨架模型。
4．在靶序列或者模版序列的有空位區(qū)域，使用環(huán)建模過(guò)程代替合適長(zhǎng)度的片段。
5．給骨架模型加上側(cè)鏈。
6．優(yōu)化側(cè)鏈的位置。
7．使用能量最小和已知的優(yōu)化知識(shí)來(lái)優(yōu)化結(jié)構(gòu)。

在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，最容易使用 BLASTP 程序比對(duì) NRL-3D 或 SCOP 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列。如果發(fā)現(xiàn)超過(guò)100個(gè)堿基長(zhǎng)度且有遠(yuǎn)高于40%序列相同率的匹配序列，則未知序列蛋白與該匹配序列蛋白將有非常相似的結(jié)構(gòu)。在這種情況下，同源性建模在預(yù)測(cè)該未知蛋白精細(xì)結(jié)構(gòu)方面會(huì)有非常大的作用。同源性建模的成功的關(guān)鍵通常不是建模使用的軟件或服務(wù)器，在設(shè)計(jì)與模版結(jié)構(gòu)好的比對(duì)時(shí)的技巧更加重要。

結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相關(guān)程序及數(shù)據(jù)庫(kù)：
常用蛋白序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)：
數(shù)據(jù)庫(kù)說(shuō)明網(wǎng)址鏈接
PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)http://www.rcsb.org/pdb
SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)http://kr.expasy.org/sprot/
PIR蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)http://pir.georgetown.edu/
OWL非冗余蛋白質(zhì)序列http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/OWL/
EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.embl-heidelberg.de/
TrEMBLEMBL的翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)http://kr.expasy.org/sprot/
GenBANK核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/
PROSITE蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)http://kr.expasy.org/prosite/
SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu)http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html
SWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示http://us.expasy.org/sw3d/
DSSP蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)http://www.cmbi.kun.nl/gv/dssp/
FSSP已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族http://www.ebi.ac.uk/dali/fssp/fssp.html
SCOP蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫(kù)http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/
CATH蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath/
Pfam蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域http://pfam.wustl.edu/

蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)：

相關(guān)概念：

1． 重疊群（contig）：
基因組測(cè)序中將許多序列片段經(jīng)過(guò)比對(duì)找到重疊區(qū)，從而連接成長(zhǎng)片段，稱重疊連續(xù)群，簡(jiǎn)稱重疊群。
2． 序列模體（motif）：
通常指蛋白序列中相鄰或相近的一組具有保守性的殘基，與蛋白質(zhì)分子及家族的功能有關(guān)。
3． Smith-Waterman算法：
1981年，Smith 和Waterman提出的一種用來(lái)尋找并比較這些具有局部相似區(qū)域的方法，即常用的Smith-Waterman算法，它也是一種基于矩陣的方法，而且也是運(yùn)用回溯法（backtracking）建立允許空位插入的比對(duì)。這個(gè)算法的一個(gè)重要特征是矩陣中每個(gè)單元均可以是比對(duì)結(jié)果序列片段的終點(diǎn)，該片段的相似性程度由該單元中的分?jǐn)?shù)值表示。
4． 計(jì)分矩陣（scoring matrix）：
記分矩陣是描述殘基（氨基酸或堿基）在比對(duì)中出現(xiàn)的概率值的表。在記分矩陣中的值是兩種概率比值的對(duì)數(shù)，一個(gè)是在序列比對(duì)中氨基酸隨機(jī)發(fā)生的概率。這個(gè)值只是指出每個(gè)氨基酸出現(xiàn)的獨(dú)立幾率的概率。另一個(gè)是在序列比對(duì)中，一對(duì)殘基的出現(xiàn)的有意義的概率。這些概率來(lái)源于已知有效的真實(shí)的序列的比對(duì)的樣本。

蛋白質(zhì)功能確定的思路及方法：

1． 通過(guò)相似序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定功能

具有相似性序列的蛋白質(zhì)具有相似的功能。因此，最可*的確定蛋白質(zhì)功能的方法是進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的相似性搜索。需要明確的是，一個(gè)顯著的匹配應(yīng)至少有25%的相同序列和超過(guò)80個(gè)氨基酸的區(qū)段。對(duì)于不少種類的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工具，快速搜索工具（如BLASTP）速度快，也很容易發(fā)現(xiàn)匹配良好的序列，一般就沒(méi)必要運(yùn)行更花時(shí)間的工具（如FASTA、BLITZ）；但當(dāng)BLASTP不能發(fā)現(xiàn)顯著的匹配時(shí)，就需要使用那些搜索速度較慢但很靈敏的工具了。所以，一般的策略就是先進(jìn)行BLASTP檢索，如果不能得到相應(yīng)的結(jié)果，就可以運(yùn)行FASTA，如果FASTA也無(wú)法得到相應(yīng)結(jié)果，最后就需要選用完全根據(jù)Smith-Waterman 算法設(shè)計(jì)的搜索程序，如 BLITZ。
比對(duì)所選用的記分矩陣對(duì)最終預(yù)測(cè)結(jié)果影響也很重要，首先，選擇的矩陣須與匹配水平相一致。PAM250應(yīng)用于遠(yuǎn)距離匹配（<25%相同比率），PAM40應(yīng)用于不很相近的蛋白質(zhì)序列，BLOSUM62為一個(gè)通用矩陣。其次，使用不同矩陣，可以發(fā)現(xiàn)始終出現(xiàn)的匹配序列，這樣可以減少誤差。

2． 確定序列特性：疏水性、跨膜螺旋等

許多功能可直接從蛋白質(zhì)序列預(yù)測(cè)出來(lái)。例如，疏水性信息可被用于跨膜螺旋的預(yù)測(cè)，還有不少小的序列模體（motif）是細(xì)胞用于特定細(xì)胞區(qū)室（cell compartment）蛋白質(zhì)的定向。對(duì)于跨膜螺旋的預(yù)測(cè)涉及到對(duì)跨膜蛋白跨膜區(qū)域的識(shí)別，這就需要鑒定序列中可以折疊成螺旋并存在于膜的疏水環(huán)境中的區(qū)域?？缒ば蛄幸话憔哂幸恍┟黠@的特征，比如，為了跨膜α螺旋必須有大約17~25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，因?yàn)榧?xì)胞膜內(nèi)部是由脂肪酸的長(zhǎng)的碳?xì)滏溄M成，所以膜中的α螺旋必須存在相對(duì)的面向膜的非極性面才能在能量上是有利的。早期的算法程序會(huì)直接分析這些特征，并通過(guò)分析序列的17~25個(gè)氨基酸的窗口，對(duì)每個(gè)窗口產(chǎn)生的疏水性得分，得分高的即被預(yù)測(cè)為跨膜螺旋，現(xiàn)在一些經(jīng)過(guò)改進(jìn)的更精確的算法，不僅提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性到90%以上，而且可以預(yù)測(cè)跨膜螺旋的一些其他特征，比如在膜上的方向。這些都依賴于一系列對(duì)已知跨膜螺旋的特征研究的成果。
3． 通過(guò)序列模體數(shù)據(jù)庫(kù)等的比對(duì)確定功能

蛋白質(zhì)不同區(qū)段的進(jìn)化速率不同，蛋白質(zhì)的一些部分必須保持一定的殘基模式以保持蛋白質(zhì)的功能，通過(guò)確定這些保守區(qū)域，有可能為蛋白質(zhì)功能提供線索。主要有兩種方法可用于序列模體的查找。一種方法是查找匹配的一致序列或序列模體。這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是快捷，序列模體數(shù)據(jù)庫(kù)龐大而且不斷被擴(kuò)充；缺點(diǎn)是有時(shí)不靈敏，因?yàn)橹挥信c一致序列或序列模體完全匹配才被列出，而近乎匹配的都將被忽略。使在做復(fù)雜分析時(shí)候受到嚴(yán)重限制。第二種方法是更加精細(xì)的序列分布型方法。原則上，分布型搜索的是保守序列（不只是一致序列），這樣可以更靈敏的找出那些相關(guān)性較遠(yuǎn)的序列。但分布型和分布數(shù)據(jù)庫(kù)需要大量的計(jì)算和人力，所以分布數(shù)據(jù)庫(kù)的記錄沒(méi)有序列模體數(shù)據(jù)庫(kù)多。在實(shí)際分析時(shí)，應(yīng)同時(shí)對(duì)這兩種類型的數(shù)據(jù)庫(kù)都進(jìn)行搜索。

結(jié)構(gòu)密碼蘊(yùn)藏在排序中

這是一個(gè)復(fù)雜但很有意思的生命過(guò)程——基因承載了生命的遺傳信息，生命的功能則是藉由蛋白質(zhì)執(zhí)行的；蛋白質(zhì)是由20種氨基酸組成的肽鏈，而DNA中的基因控制了蛋白質(zhì)中氨基酸種類的排序。蛋白質(zhì)只有在折疊的狀態(tài)下才能表現(xiàn)出生命的功能，但折疊是如何自發(fā)形成的呢？

氨基酸序列與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系研究源于美國(guó)生物化學(xué)家安芬森（C.Anfinsen）。1961年，他研究了核糖核酸酶的去折疊和重折疊過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在相同的環(huán)境中去折疊的蛋白質(zhì)都會(huì)恢復(fù)到原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，認(rèn)為蛋白質(zhì)鏈會(huì)以自由能最低的方式形成三維結(jié)構(gòu)，由此推測(cè)蛋白質(zhì)的折疊密碼隱藏在氨基酸排序中，即所謂的安芬森原則：蛋白質(zhì)一級(jí)排序決定三維結(jié)構(gòu)。因?yàn)椤皩?duì)控制蛋白質(zhì)鏈折疊原理的研究”，安芬森獲得1972年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

然而，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，該如何確定呢？現(xiàn)在有兩種方法：一種是實(shí)驗(yàn)測(cè)量，包括用X射線衍射和核磁共振成像；一種是理論預(yù)測(cè)，利用計(jì)算機(jī)根據(jù)理論和已知的氨基酸序列等信息來(lái)預(yù)測(cè)，方法包括同源結(jié)構(gòu)模擬、折疊辨識(shí)模擬和基于第一性原理的從頭計(jì)算。

1913年，勞爾和布拉格父子第一次發(fā)現(xiàn)X射線通過(guò)晶體可以產(chǎn)生衍射現(xiàn)象從而確定原子在晶體中的位置并因此獲得諾貝爾獎(jiǎng)。1957年，劍橋大學(xué)的肯德魯用勞爾-布拉格的方法確定出第一個(gè)蛋白質(zhì)(肌紅蛋白)的三維結(jié)構(gòu)從而獲得1962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。此后18年間,人類共測(cè)出38個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；至1980年，這個(gè)數(shù)目增長(zhǎng)到184個(gè)。

顯然，用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)量蛋白質(zhì)及生物大分子的結(jié)構(gòu)相當(dāng)繁瑣。張陽(yáng)說(shuō)：“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力。多年前測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)就有可能獲得諾貝爾獎(jiǎng)。如今隨著技術(shù)的進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的時(shí)間和花費(fèi)已經(jīng)大大地減少了，但測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的平均費(fèi)用也在100萬(wàn)美元左右。”

自然界有大量種類的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)只能測(cè)出其中非常小的一部分，目前“蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)”中只有3萬(wàn)多個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。有沒(méi)有其他方法可以更快、更經(jīng)濟(jì)地測(cè)量出大量蛋白質(zhì)呢？

物含妙理總堪尋

既然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的密碼隱藏在序列中，那么解開(kāi)這個(gè)密碼就可以通過(guò)序列來(lái)解開(kāi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。張陽(yáng)說(shuō)：“我們的目的就是用計(jì)算機(jī)從氨基酸的序列來(lái)直接預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。將序列輸進(jìn)計(jì)算機(jī)里，設(shè)計(jì)一套程序，讓計(jì)算機(jī)去計(jì)算和確定蛋白質(zhì)中每個(gè)原子的三維坐標(biāo)。如果這種理論方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證可行，那么就可能通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這幾乎是免費(fèi)的?！?/p>

然而，用序列預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)談何容易。驅(qū)動(dòng)氨基酸折疊形成特定三維空間的作用諸多，包括氨基酸側(cè)鏈分子間作用力、水分子表面張力、氨基酸側(cè)鏈分子間的電偶極距和電磁力以及它與水分子的相互作用等。根據(jù)數(shù)學(xué)計(jì)算，由100個(gè)氨基酸構(gòu)成的小蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象可能會(huì)有1050種空間結(jié)構(gòu)。

物含妙理總堪尋。一種氨基酸序列只可能有一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這就是計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的意義所在。根據(jù)安芬森的熱動(dòng)力學(xué)原理，蛋白質(zhì)在細(xì)胞中應(yīng)該處在它與環(huán)境的自由能最低態(tài)。這意味著可以根據(jù)物理、化學(xué)、生物學(xué)等知識(shí)來(lái)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的能量函數(shù)，因此尋找這種最低自由能所代表的結(jié)構(gòu)。

科學(xué)家們使出十八般武藝來(lái)預(yù)測(cè)序列與結(jié)構(gòu)間的密碼，尋找出三種有代表性的預(yù)測(cè)方法：同源結(jié)構(gòu)模擬（Homology Modeling）、折疊辨識(shí)模擬（Fold Recognition）和基于“第一原則”的從頭計(jì)算方法（Ab Initio）。

同源模擬又稱為比較性模擬。如果目標(biāo)蛋白質(zhì)與已測(cè)出結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的序列有30%以上的相似，那么這兩種蛋白質(zhì)可被視為同源，它們也應(yīng)該有類似的空間結(jié)構(gòu)。因此，若知道同源蛋白質(zhì)家族中的某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，就可利用它們作為模板來(lái)模擬目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這種方法速度較快，精度也比較高。但是這種方法有局限性，畢竟已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)數(shù)量很少，而且很多蛋白質(zhì)沒(méi)有同源系列。

折疊辨識(shí)模擬又稱串線指認(rèn)方法，意思是指把目標(biāo)蛋白序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行逐一對(duì)比。自然界中有些蛋白質(zhì)的氨基酸序列不大相同，但其結(jié)構(gòu)極為相似。張陽(yáng)說(shuō)：“這對(duì)我們建立新計(jì)算機(jī)模型非常有用。在無(wú)法進(jìn)行序列比對(duì)的情況下，我們就想辦法用目標(biāo)序列直接與已有的其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。具體做法是，設(shè)計(jì)一個(gè)打分系統(tǒng)，讓計(jì)算機(jī)來(lái)識(shí)別這個(gè)序列放在被比較的其他蛋白質(zhì)上是否‘舒服’，再根據(jù)得分高低判斷序列是否會(huì)折疊成這種結(jié)構(gòu)，評(píng)分系統(tǒng)是這種方法的關(guān)鍵。”

“從頭計(jì)算”方法源于安芬森的“最低自由能構(gòu)型假說(shuō)”。前兩種方法是用已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為模板來(lái)構(gòu)建新的結(jié)構(gòu)，而“從頭計(jì)算”不需要模板，它是以物理為基礎(chǔ)來(lái)研究蛋白質(zhì)的折疊方法，怎樣設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)哪芰亢瘮?shù)，怎樣找到相應(yīng)的最低自由能是這種方法的關(guān)鍵。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)免費(fèi)服務(wù)

目前已經(jīng)有許多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)通過(guò)因特網(wǎng)對(duì)公眾免費(fèi)開(kāi)放。由于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)本身的局限性，每種預(yù)測(cè)服務(wù)都各有得失。 我們簡(jiǎn)要介紹幾種國(guó)際上較為常用的預(yù)測(cè)服務(wù)的優(yōu)缺點(diǎn)、使用方法及工作原理。

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（同源建模）：

瑞士生物信息研究所 SWISS-MODEL

丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心 CPHmodels

比利時(shí)拿摩大學(xué) ESyPred3D

英國(guó)癌癥研究中心 3DJigsaw

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（折疊識(shí)別）：

美國(guó)哥倫比亞大學(xué) PredictProtein

英國(guó)瓦衛(wèi)克大學(xué) PSIpred

印度昌迪加爾的微生物技術(shù)研究所 APSSP

歐洲生物信息研究所（EBI）Jpred

美國(guó)加利福尼亞大學(xué) SSpro

α－螺旋傾向性預(yù)測(cè)（從無(wú)到有）：

歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL) AGADIR

AGADIR Service

AGADIR —— 一種預(yù)測(cè)肽鏈中螺旋含量的算法

AGADIR是一種基于螺旋/卷曲轉(zhuǎn)化理論，可以在殘基水平上準(zhǔn)確預(yù)測(cè)單體肽螺旋行為的算法。利用此算法，可以預(yù)測(cè)肽鏈的平均螺旋含量、α碳和α氫原子的構(gòu)象、偶合常數(shù)、及N-Cap、C-Cap等參數(shù)。通過(guò)用圓二色性法和核磁共振法的測(cè)評(píng)，此算法對(duì)短肽鏈，即三級(jí)相互作用不明顯時(shí)，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確很高。

利用AGADIR的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，可以參考之對(duì)肽鏈螺旋，及至蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)修飾，以達(dá)到特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，或進(jìn)行其它應(yīng)用。

到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。近年來(lái)還出現(xiàn)了一種新的方法，叫做Electron Microscopy。

其中X射線的方法產(chǎn)生的更早，也更加的成熟，解析的數(shù)量也更多，我們知道，第一個(gè)解析的蛋白的結(jié)構(gòu)，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發(fā)展起來(lái)的。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
首先來(lái)說(shuō)一下，這兩種方法的一般的步驟和各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

電子顯微鏡（electron microscopy）作為一種新型的技術(shù)，目前的應(yīng)用還是非常少，并且比較狹窄，到最后在給它作些介紹，而且相信絕大多數(shù)人也沒(méi)有聽(tīng)說(shuō)過(guò)，也不會(huì)有很大的興趣。

首先是X晶體衍射。首先要得到蛋白質(zhì)的晶體。
通常，都是將表達(dá)蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達(dá)載體中，然后在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，提純之后摸索結(jié)晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80％，將晶體進(jìn)行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過(guò)一系列的計(jì)算，很快就能得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。
用x射線的優(yōu)點(diǎn)是：速度快，通常只要拿到晶體，甚至當(dāng)天就能得到結(jié)構(gòu)，另外不受大小限制，無(wú)論是多大的蛋白，或者復(fù)合體，無(wú)論是蛋白質(zhì)還是RNA、DNA，還是結(jié)合了什么小分子，只要能夠結(jié)晶就能夠得到其原子結(jié)構(gòu)。
所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結(jié)晶的條件。這個(gè)時(shí)候運(yùn)氣就顯的特別重要。關(guān)于這個(gè)有好多有趣的離子。據(jù)說(shuō)國(guó)外一個(gè)同學(xué)在摸索兩個(gè)月無(wú)果之后，毅然去度假，就將蛋白扔在一個(gè)很隨便的地方，等度假回來(lái)之后，卻發(fā)現(xiàn)已經(jīng)結(jié)晶了。
然后，來(lái)說(shuō)一下NMR。
NMR（nuclear magnetic resonance）現(xiàn)象早已發(fā)現(xiàn)了很久，然后將這種方法用來(lái)解析蛋白結(jié)構(gòu)，卻是近一二十年的事情。不過(guò)到今天為止，用nmr方法來(lái)解析結(jié)構(gòu)已經(jīng)十非常成熟的方法。
原理暫且放在一邊，先說(shuō)常規(guī)步驟。
首先通過(guò)基因工程的方法，表達(dá)出目的蛋白，提純之后，摸索一下蛋白穩(wěn)定的條件，如果蛋白沒(méi)有聚合，而且折疊良好，便將蛋白樣品（通常是1mM－3mM，500ul，Ph6－7的PBS）裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后用一系列寫好的程序控制譜儀，發(fā)出一系列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N13、C13原子，等電磁波發(fā)射完畢，在收集受激發(fā)的原子所放出的“能量”，其實(shí)也是小磁場(chǎng)，通過(guò)收集數(shù)據(jù)、譜圖處理、電腦計(jì)算從而得到蛋白的原子結(jié)構(gòu)。
它的優(yōu)點(diǎn)就是，蛋白在液體中得到結(jié)構(gòu)，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，事實(shí)上所有在pdb中或者文獻(xiàn)中發(fā)表的NMR結(jié)構(gòu)都是十個(gè)或者二十個(gè)結(jié)構(gòu)的ensemble（集合），這就是因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)都是進(jìn)行能量?jī)?yōu)化后符合條件的結(jié)構(gòu)，或者說(shuō)就是溶液中的蛋白結(jié)構(gòu)。因?yàn)槭莿?dòng)態(tài)就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。缺點(diǎn)是，受大小的限制，到目前為止NMR解析蛋白結(jié)構(gòu)的上限是50kd。

無(wú)論是晶體還是NMR，蛋白都要符合下面的條件：首先表達(dá)量要大，象NMR要求1個(gè)mM500UL，這就要求十幾個(gè)毫克，結(jié)晶要摸索很多的條件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞質(zhì)中表達(dá)才行。其次，蛋白要折疊。我們知道許多蛋白，尤其是真核蛋白在大腸桿菌中是以包含體的形式存在，這種情況下是不行的，除非復(fù)性。如果你的蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)，如果你不確定是不是表達(dá)，可以從分子篩上的位置，或者掃CD確定一下，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的是做一個(gè)NMR一維譜，只需要幾分鐘。
小于20Kd的蛋白可以考慮NMR，因?yàn)镹MR研究功能核相互作用方面是更加擅長(zhǎng)的，而且不需要結(jié)晶，現(xiàn)在速度也不慢。如果比較大，可以考慮晶體解析。

蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位
關(guān)于蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)，In general，預(yù)測(cè)方法分為3個(gè)步驟。首先，為每一類亞細(xì)胞locations構(gòu)建客觀而具有代表性的數(shù)據(jù)集。其次，從數(shù)據(jù)集中提取特征參數(shù)或 descriptor。最后也是最關(guān)鍵的一步，通過(guò)算法比較查詢序列中所包含的特征參數(shù)與各類相應(yīng)的location的相似度，作出判斷，一般會(huì)用一組概率的形式來(lái)表述。很明顯，其中大量運(yùn)用的是機(jī)器學(xué)習(xí)理論和統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法。對(duì)算法有興趣的朋友可以參考下面這一篇綜述，“An overview on predicting the subcellular location of a protein” In Silico Biology 2002http://www.bioinfo.de/isb/2002/02/0027/main.html

以下是該綜述中涉及的部分server，都是比較經(jīng)典的。

PSORT：http://psort.nibb.ac.jp
By amino acid composition information and sorting signal knowledge

TargetP：http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
By discriminating the individual targeting signal peptide

MitoProt：http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html
By discriminating mitochondrial and chloroplast signal peptide

Predotar：http://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar/
By discriminating mitochondrial, chloroplast signal peptide

NNPSL：http://predict.sanger.ac.uk/nnpsl
By amino acid composition

SobLoc：http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/
By amino acid composition

SubLoc: http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/
By more sequence information besides the amino acid composition

一篇文獻(xiàn)：http://cubic.bioc.columbia.edu/papers/2003_loci_3dnet/paper.html

“Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information”

找到一些晶體學(xué)的原理。一起學(xué)習(xí)。
蛋白質(zhì)純化與結(jié)晶
獲得蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)的第一個(gè)瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質(zhì)(>10 mg)，其濃度通常在10 mg/ml 以上，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選。運(yùn)用重組基因的技術(shù)，將特定基因以選殖(clone)的方式嵌入表現(xiàn)載體(expression vector)內(nèi)，此一載體通常具有易于調(diào)控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長(zhǎng)的菌體中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，在菌體快速生長(zhǎng)的同時(shí)，也大量生產(chǎn)表現(xiàn)載體上的基因所解譯出之蛋白質(zhì)。一般而言純度越高的蛋白質(zhì)比較有機(jī)會(huì)形成晶體，因此純化蛋白質(zhì)的步驟就成為一個(gè)重要的決定因素。

在取得高純度的蛋白質(zhì)溶液后，接下來(lái)就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質(zhì)晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產(chǎn)生的，每一種蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學(xué)上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度等；物理上的變數(shù)，如溶液達(dá)成過(guò)飽和狀態(tài)的速率、溫度等；及生化上的變數(shù)，如蛋白質(zhì)所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)、等電點(diǎn)等，皆是養(yǎng)晶時(shí)的測(cè)試條件。截至目前為止，并無(wú)一套理論可以預(yù)測(cè)結(jié)晶的條件，所以必須不斷測(cè)試各種養(yǎng)晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體(圖一) 。

蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)，通常是利用氣相擴(kuò)散法(Vapor Diffusion Method) 的原理來(lái)達(dá)成；也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)(10-50 mg/ml)溶液加入適當(dāng)?shù)娜軇?，慢慢降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來(lái)說(shuō)，我們將蛋白質(zhì)溶于低濃度(~1.0 M) 的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度(~2.0 M)硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨的濃度，進(jìn)而達(dá)成結(jié)晶的目的(圖二)。

蛋白質(zhì)晶體在外觀上與其他晶體并無(wú)明顯不同之處，但在晶體的內(nèi)部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質(zhì)晶體除了蛋白質(zhì)分子外，其他的空間則充滿約40 %至60 %之間的水溶液，其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質(zhì)分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成晶體處理時(shí)的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點(diǎn)。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質(zhì)分子在晶體內(nèi)與水溶液中的狀態(tài)，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，基本上可視為自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。

繞射數(shù)據(jù)的記錄
X 光繞射點(diǎn)搜集，隨著時(shí)間的推移，也由早期以閃爍計(jì)數(shù)器(scintillation counter) 一次記錄一個(gè)點(diǎn)及使用許多X-光片(X-ray film) 拍下繞射點(diǎn)，每張X 光片都要經(jīng)過(guò)顯影的步驟；之后進(jìn)而使用多重金屬絲板(multiwire)自動(dòng)記錄每次偵測(cè)到的繞射點(diǎn)。目前使用的熒光記錄板(image plate)，則是利用磷化物經(jīng)X 光激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生熒光，經(jīng)熒光掃描儀記錄成數(shù)字模式的圖像文件后，再以燈光照射一段時(shí)間去除記錄板上的熒光點(diǎn)，即可再進(jìn)行下一次的記錄工作。電荷耦合器(charge-coupled devices, CCD) 的出現(xiàn)及技術(shù)的改良，可以不斷地記錄繞射點(diǎn)，而不需熒光板掃描及去除步驟，如此將加速繞射點(diǎn)的搜集。目前的同步輻射光源幾乎全部使用CCD 來(lái)記錄繞射數(shù)據(jù)(圖三)。
在實(shí)驗(yàn)室中的X 光光源的產(chǎn)生，一般使用銅作為旋轉(zhuǎn)式陽(yáng)極靶(rotating anode)，可以產(chǎn)生波長(zhǎng)為1.54 ? Cu Kα放射光。不過(guò)，以目前發(fā)表的文獻(xiàn)來(lái)看，在同步輻射(synchrotron)光源所搜集的資料有增加的趨勢(shì)，因?yàn)橥捷椛渌峁┑腦 光束，其強(qiáng)度較實(shí)驗(yàn)室強(qiáng)約百倍、甚至上千倍，同時(shí)它也可以改變不同頻段的波長(zhǎng)，以供非尋常散射(anomalous dispersion) 的實(shí)驗(yàn)研究

繞射原理
單一分子在X 光下的訊號(hào)極弱，無(wú)法被記錄下來(lái)，然而在晶體中通常是由許多排列整齊的蛋白質(zhì)分子所組成，當(dāng)晶體內(nèi)所有的分子(數(shù)量約在1015 個(gè)以上)一起在同一個(gè)方向上進(jìn)行繞射且繞射波皆同步時(shí)，即足以使所產(chǎn)生的訊號(hào)被記錄下來(lái)。每一個(gè)繞射波的強(qiáng)度與其振幅(amplitude)的平方成正比。但繞射波的另一個(gè)變數(shù)，繞射波的相角(phase)，則無(wú)法直接測(cè)量得到，必須利用其他的方法方能獲得(見(jiàn)相角決定方法)。若是繞射點(diǎn)振幅與相角都可獲知，則可以進(jìn)一步地來(lái)計(jì)算晶體中的電子密度圖。
下列方程式即是著名的傅立葉轉(zhuǎn)換公式，ρ表示在晶體中任何一個(gè)位置上(x, y, z) 的電子密度，φhkl 為繞射光相角，|Fhkl|為繞射光振幅，可由實(shí)驗(yàn)測(cè)得的繞射光強(qiáng)度開(kāi)平方獲得。
所以若是記錄了所有的繞射波的強(qiáng)度(h,k,l)，并計(jì)算出所有繞射光的相角，帶入這個(gè)公式，蛋白質(zhì)在晶體內(nèi)的結(jié)構(gòu)，就以電子密度圖的方式呈現(xiàn)在我們的眼前了(圖四)。
相角決定方法
決定相角通常有三種常用的方法，分別是同型置換法(isomorphous replacement method) 、非尋常散射法(anomalous dispersion method) 以及分子置換法(molecular replacement) ，現(xiàn)在分述如下：
(1）同型置換法
同型重原子置換法最早的應(yīng)用是在1954 年，用來(lái)解出血紅蛋白hemoglobin 的相角，需要在晶體蛋白質(zhì)的內(nèi)部加入重原子。通常以浸泡的方法使重原子能夠滲透(diffuse) 進(jìn)入到晶體內(nèi)部和蛋白質(zhì)結(jié)合。這些重原子對(duì)X 光產(chǎn)生較大的繞射，對(duì)繞射點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)有明顯的差異，根據(jù)這些差異，可定出重原子的位置，并進(jìn)而推算出蛋白質(zhì)晶體繞射光的相角。理論上，若是只獲得一組重原子衍生物數(shù)據(jù)(single isomorphous replacement, SIR)，經(jīng)計(jì)算后，其解并不是唯一的；因此通常會(huì)結(jié)合數(shù)個(gè)不同的重原子衍生物所得到的數(shù)據(jù)(multiple isomorphous replacement, MIR)， 來(lái)求得更精確的相角。
(2) 非尋常散射法
較重的原子會(huì)吸收特定波長(zhǎng)的X 光，運(yùn)用接近吸收邊緣(absorption edge)的X 光進(jìn)行繞射實(shí)驗(yàn)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不尋常的X 光散射或吸收現(xiàn)象，稱為非尋常散射(anomalous scattering)，此一現(xiàn)象可導(dǎo)致繞射振幅及相角的改變。經(jīng)由數(shù)個(gè)不同波長(zhǎng)的X 光照射，記錄吸收邊緣前后所產(chǎn)生的不同繞射結(jié)果，可依此計(jì)算出相角。由于它使用數(shù)個(gè)不同波長(zhǎng)，所以稱為「多波長(zhǎng)非尋常散射法」(multiwavelength anomalous dispersion, MAD) 。使用這個(gè)方法的前提是X 光的波長(zhǎng)需依重原子的特性加以調(diào)整，而一般在實(shí)驗(yàn)室的X 光通常是屬于固定波長(zhǎng)的，并無(wú)法滿足這個(gè)方法，所以非尋常散射法就需要利用同步輻射可變波長(zhǎng)的光源來(lái)完成(5)。目前很多實(shí)驗(yàn)室使用硒化甲硫胺酸(selenomethionine)來(lái)取代甲硫胺酸 (methionine)，在養(yǎng)菌的同時(shí)加入硒化甲硫胺酸，使蛋白質(zhì)的形成過(guò)程帶入含有重原子硒的硒化甲硫胺酸，接下來(lái)養(yǎng)出蛋白質(zhì)晶體，在硒的吸收邊緣進(jìn)行繞射實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用MAD 的方法來(lái)計(jì)算出蛋白質(zhì)晶體繞射波的相角(圖四)。
(3) 分子置換法
若是一個(gè)未知的蛋白質(zhì)與另一已解出結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，在胺基酸序列具有30 %以上的一致性(identity)，表示這兩個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能類似，可以利用分子置換法來(lái)計(jì)算出未知蛋白質(zhì)的相角。利用已知蛋白質(zhì)之結(jié)構(gòu)分子帶入晶體中尋找旋轉(zhuǎn)及位移的可能位置，解析出結(jié)構(gòu)。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的增加，可以發(fā)現(xiàn)類似的蛋白質(zhì)具有相同的折迭方式，而出現(xiàn)新的折迭的機(jī)率也相對(duì)減少，所以只要未知的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank, PDB )中，找到序列上具有同源性(homology)的已知結(jié)構(gòu)時(shí)，即可在取得晶體繞射數(shù)據(jù)后，快速地運(yùn)用分子置換法來(lái)解決相角問(wèn)題。

三維結(jié)構(gòu)模型之建立及修正
藉由電子密度圖的三維構(gòu)形，可將每一個(gè)胺基酸依蛋白質(zhì)序列建立蛋白質(zhì)的起始模型。蛋白質(zhì)的起始模型，常由于相角的解不夠完美，使計(jì)算出來(lái)的電子密度圖產(chǎn)生誤差，誤導(dǎo)模型的走向，因此需要做進(jìn)一步的改善，稱為修正(refinement)。修正的目的在于進(jìn)行立體化學(xué)(stereochemistry)(如勝 鍵鍵長(zhǎng)、鍵角、胺基酸構(gòu)形)優(yōu)化的同時(shí)，減少計(jì)算與實(shí)驗(yàn)繞射點(diǎn)強(qiáng)度的差異，用來(lái)評(píng)估的數(shù)值則是「剩余值(R-factor)」：

其中Fobs 及Fcalc 分別表示觀察值與計(jì)算值的繞射光振幅。盡可能將剩余值降到最低，直到進(jìn)一步的修正無(wú)法減少其值為止，即達(dá)最終的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型。大部分修正后可接受的剩余值約0.2 (20%)。但低的剩余值，并不代表其結(jié)構(gòu)就是正確的。已有數(shù)個(gè)例子顯示在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的某些部分不正確時(shí)，仍可能獲得較低的剩余值。因此Brünger (7)在1992 年提出一個(gè)交互驗(yàn)證的程序，也就是取出部分的繞射點(diǎn)(建議為10%)，排除于修正的程序之外，以對(duì)結(jié)構(gòu)的正確性，提供個(gè)別的檢查，稱為「自由剩余值(R-free) 」，其計(jì)算方式同剩余值。除了剩余值外，分辨率是另一個(gè)判斷晶體結(jié)構(gòu)可信度的重要數(shù)值。分辨率在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中通常是定義為：可以分辨二個(gè)平面的最小距離。分辨率對(duì)模型的建構(gòu)所造成的影響，可以直接由電子密度圖看出，在低分辨率(~6 ? )時(shí)，只能觀察到由α螺旋(α-helix)所形成的圓柱形密度圖；隨著分辨率提高(3 ? ~ 2 ? ) ，主鏈與支鏈結(jié)構(gòu)就會(huì)出現(xiàn)，但個(gè)別原子仍無(wú)法由密度圖中看出，除非分辨率可以達(dá)到1.0 ? 或更高的分辨率。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所能達(dá)到的分辨率，主要是取決晶體內(nèi)分子排列的整齊程度。小分子晶體內(nèi)并沒(méi)有太多的水分子，所以常能得到分辨率高于0.5 ? 的繞射數(shù)據(jù)。但因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由長(zhǎng)的勝 鏈所組成，其間又是由較弱的氫鍵及凡得瓦力所維系，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)富有彈性，蛋白質(zhì)分子與分子的堆棧也就沒(méi)有那么整齊。同時(shí)分子與分子之間的空隙由水分子來(lái)填補(bǔ)，也因這些空隙的水分子排列比較紊亂，所以蛋白質(zhì)晶體繞射出的結(jié)果，僅有少數(shù)高分辨率晶體，一般蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的分辨率約在2.0 至3.0 ? 之間。

生物信息學(xué)簡(jiǎn)概及教程（經(jīng)典）

一、數(shù)據(jù)庫(kù)

注：Display中選FASTA形式，顯示原始的核苷酸數(shù)據(jù)，便于復(fù)制。

（2）dbEST
EST來(lái)源于mRNA
－基因片度（300-400bp，數(shù)據(jù)長(zhǎng)度足以分析編碼的產(chǎn)物）或者全基因（已知）
－5’端或3’端的cDNA序列（EST）
－300-400bp single-pass sequence （可能有誤，如果要求<0.1%的錯(cuò)誤率，需要測(cè)序8-10次）
－GenBank中71%以上的是EST序列。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html

（3）UniGene
來(lái)源于同一基因的非重復(fù)EST，組成基因序列群（contig）
注：不同實(shí)驗(yàn)室各自采用poly（T）15法和隨機(jī)引物合成的cDNA（不完整），不同的cDNA的加工、拼接，形成重疊群（Contig） http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/

（4）dbSTS （sequence tagged sites）
a.短序列（200-500bp） b.已完成染色體上的定位 c.可以與電子PCR相連用
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbSTS/index.html

（5）dbGSS （genome survey sequence）
a.基因組短序列 b. cosmid、BAC、YAC外源插入片斷末端序列 c. Alu PCR 序列
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbGSS/index.html

（6）HTG （high-throughput genome sequence）
尚未完成測(cè)序的重疊群（>2kb） 更新快?。?！
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HTGS/

（7）dbSNP
每100-300bp有一個(gè)SNP
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

（8）EMBL
http://www.ebi.ac.uk/embl/

（9）DDBJ
http://www.ddbj.nig.ac.jp/

（10）EPD （Eukaryotic Promoter Database） 啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)
http://www.genome.jp/dbget/dbget2.html

2．蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)
（1）SWISS-PROT
http://us.expasy.org/sprot/
有詳細(xì)的注釋序列；與44個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)相互參照（cross-reference）
(2)TrEMBL (translation of EMBL)

(3)PIR (Promoter information resource)
http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/
表明了結(jié)構(gòu)域

（4）PRF （Promoter research foundation）
http://www4.prf.or.jp/

（5）PDBSTR （Re-organized Protein data Bank）
http://us.expasy.org/sprot/prosite.html
蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、α-碳位置

（6）Prosite
蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域
http://us.expasy.org/prosite/

3．結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)
（1）PDB (Protein Data Bank)
http://www.rcsb.org/pdb/

(2) NDB (Nucleic Acid Database)
http://ndbserver.rutgers.edu/NDB/ndb.html

(3)DNA-bind Protein database
http://ndbserver.rutgers.edu/NDB/structure-finder/protein/index.html

（4）swiss-3D IMAGE
http://www.expasy.ch/sw3d/

4．酶和代謝數(shù)據(jù)庫(kù)
（1）KEGG （Kyoto Eneyclopedin of genes & genemes）
http://www.genome.ad.jp/kegg/

(2)PKR (Protein Kinase Resource)
http://www.sdsc.edu/kinases

5．文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)
（1）PubMed
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/

（2）OMIM
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim

（3）Agricola
http://agricola.nal.usda.gov/
農(nóng)業(yè)相關(guān)的文獻(xiàn)

6．提交數(shù)據(jù)
GenBank
BankIt提交
網(wǎng)上直接提交，立即得到臨時(shí)編號(hào)（1周內(nèi)提供Aceesion No.）
SequIn提交 下載軟件填寫表格，自動(dòng)確定CDS、ORF和查找重復(fù)序列、查載體序列
用Update功能修改

二、檢索數(shù)據(jù)庫(kù)的方法
1、用關(guān)鍵詞或詞組進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 Text-based database searching
2、用和甘肅或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 Sequence-based database searching
關(guān)鍵詞：名詞；描述性詞、詞組；Accession number
體系：Entrz；Sequence retrieval system (SRS)；Integrated database retrieval system (DBGET)
檢索須知
1、連接詞：AND OR NOT
用引號(hào)將兩個(gè)詞組成一個(gè)詞組 “disease resistance” 表示必須兩個(gè)詞先后順序連續(xù)出現(xiàn)；disease resistance 表示默認(rèn)AND
2、wild card “*” 放在單詞后使檢索范圍擴(kuò)大，但是專一性降低
Wan*=所有以Wan開(kāi)頭的單詞 enzyme*=enzyme + enzymes 單復(fù)數(shù)同
（1）Entrz（NCBI）
優(yōu)點(diǎn)：三種檢索體系中最容易操作的； 缺點(diǎn)：檢索范圍有限
8大類29個(gè)與Entrz體系相連的數(shù)據(jù)庫(kù)
1、Nucleiotide sequence database(6)
GenBank; SNP; Gene; Homologene; UniSTS; ProSet
2、Protein sequence database(1)
Proteins
3、Structure database(4)
Structure; PubChem; Compound; 3D-Domain; CDD
4、Taxonomy database(1)
Taxonomy
5、Genome database(2)
Genomes; Genome Project
6、Expression database(4)
UniGene; GEO Profiles; GEO database;GENSAT
注：數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于mRNA－cDNA－protein（更確切）
7、Literature database(7)
PubMed（文摘）; PubMed central（全文）; Books; OMIM; Journals; NLM catalog; MeSH
8、Others
PubChem substance; Cancer chromosome; PubChem BioAssay; SiteSearch
檢索方法：a、數(shù)據(jù)庫(kù)間的檢索 b、選擇數(shù)據(jù)庫(kù) （可以限定檢索內(nèi)容和時(shí)間范圍）

（2）SRS (Sequence Retrieval System)
http://srs.ebi.ac.uk/ 有不同的版本，可以下載。
EBI 優(yōu)點(diǎn)：檢索面寬 缺點(diǎn)：檢索復(fù)雜
***類194個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)與SRS體系相連
檢索方法：a、快速檢索（操作簡(jiǎn)單，檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)有限，適用于明確目標(biāo)的檢索。） b、深入檢索（檢索稍微復(fù)雜，檢索全部的數(shù)據(jù)庫(kù)，適用范圍廣泛的檢索。）

（3）DBGET
http://www.genome.jp/dbget/dbget2.html
優(yōu)點(diǎn)：與KEGG相連，操作較SRS簡(jiǎn)單 缺點(diǎn)：檢索面較窄
檢索方法：a、Basic search b、Advanced search

三、核苷酸和蛋白質(zhì)序列為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 Sequence-based database searching
1、序列對(duì)位排列（sequence alignment）
2、將兩條或多條序列對(duì)位排列，突出相似的結(jié)構(gòu)區(qū)域（分析功能、分析物種進(jìn)化、檢測(cè)突變，插入或缺

失、序列延長(zhǎng)、序列定位、基因表達(dá)譜分析） 3、序列對(duì)位排列分析種類
a、序列對(duì)庫(kù)對(duì)位排列分析 （從數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找同源序列，主要涉及核苷酸庫(kù)和蛋白質(zhì)庫(kù)）
b、兩序（多序列）列對(duì)位排列分析

（一）序列對(duì)位排列分析的基本原理
1、記分矩陣（scoring matrix）
a、蛋白質(zhì)序列對(duì)位排列分析記分復(fù)雜
b、一致氨基酸記分不同 稀有氨基酸分值高，普通氨基酸分值低
c、相似氨基酸也積分，如D-E 用“＋”表示氨基酸殘基性質(zhì)相似

2、空位（間隔）罰分（gap penalty）
基因進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生突變（插入、缺失）
序列對(duì)位排列分析是允許插入空位
空位罰分涉及兩個(gè)參數(shù)：空位開(kāi)放（gap opening） 空位延伸（gap extension）

（二）序列對(duì)庫(kù)對(duì)位排列分析
對(duì)待分析的序列對(duì)庫(kù)進(jìn)行相似性分析；重復(fù)許多次的兩序列對(duì)位排列分析；從數(shù)據(jù)庫(kù)找出所以的同源序列
主要檢索體系：BLAST、FASTA、Blitz
1、基本概念
a、sequence identity 兩序列在同一位點(diǎn)核苷酸或氨基酸殘基完全相同
sequence similarity（or opositive） 兩序列在同一位點(diǎn)核苷酸或氨基酸殘基化學(xué)性質(zhì)相似
b、Global alignment 完整的序列比較
Local alignment 兩序列相似程度最高的片斷相比較
c、Gapped alignment 為達(dá)到佳a(bǔ)lignment序列中加入空位
Ungapped alignment 相比較的核苷酸或氨基酸殘基連續(xù)
d、Alignment score 衡量?jī)上啾刃蛄邢嗨瞥潭鹊臉?biāo)準(zhǔn)
E (expect) value 期望得到的，完全由機(jī)會(huì)造成的，相當(dāng)于或大于目前分值的alignment次數(shù)
Raw score 原始分，分值較大，兩個(gè)比較序列相似性程度較大
Bit score 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以原始分為基礎(chǔ)計(jì)算
E＝10 ；表示方法5e-46=5×10-46 E越小越好
可以接受的標(biāo)準(zhǔn)：E＝10-5 （重疊位置>40bp；identity>94%；遠(yuǎn)大于雜交標(biāo)準(zhǔn)）
E＝10-30 基因組分析，功能與序列中相似
E取決于alignment分值，相比較序列的長(zhǎng)短和庫(kù)中數(shù)據(jù)數(shù)量
e、Low-complexity alignment region(LCR)
核苷酸序列中短的重復(fù)序列或由少數(shù)幾種核苷酸或氨基酸殘基組成的序列（如polyA）
數(shù)據(jù)庫(kù)中半數(shù)以上的序列至少帶有一處LCR
序列alignment 應(yīng)避免LCR相互配對(duì)得分
BLAST用Filter功能避免比較LCR 用X和N分別代表LCR中的每個(gè)氨基酸殘基和核苷酸

2、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）
（1） Nucleiotide Blast (Blastn)
(2) Protein Blast (Blastp、PSI blast、PHI blast；Conserved domain (rpsblast)
(3) Translated blast (blastx；tblstn；tblsatx)
(4) Special Blast (Blast 2 sequence；bl2seq；VecScreen)
BLAST program
Blastn 用核苷酸序列檢索核苷酸庫(kù)
BlastP 用氨基酸序列檢索蛋白質(zhì)庫(kù)
Blastx 用核苷酸序列通過(guò)6種閱讀框翻譯成不同的氨基酸序列檢索蛋白質(zhì)庫(kù)
tblastn 將蛋白質(zhì)序列譯成不同的核苷酸序列檢索核苷酸庫(kù) tblastx 將核苷酸序列通過(guò)6種閱讀框翻譯成

不同的氨基酸序列檢索核苷酸庫(kù)（庫(kù)中的序列也被譯成不同的氨基酸序列）
Blast database
nr (nucleiotide blast) GenBank（無(wú)EST、STS、GSS、HTGS）
nr (protein blast) GenBank CDS translation + PDB + SwissProt + PIR + PRF
(1)BLASTN 序列的粘貼（或用GI號(hào)）－選擇database－Autoformat（full/semi）
(2)BLASTP
(3)PSI-blast (Position Specific Iterated Blast) 氨基酸序列檢索；重復(fù)循環(huán)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。 注意：

PHI和PSH同一網(wǎng)頁(yè)，需要設(shè)定。
（4）PHI-blast (Pattern Hit Initiated Blast） 蛋白質(zhì)并帶有特殊的結(jié)構(gòu)域（pattern）檢索庫(kù)中的

相似蛋白質(zhì)（帶有同樣的特殊結(jié)構(gòu)域或者這一臨近的序列與被查找的序列相似。） 與PSI-blast相連，可

以循環(huán)檢索。
（5）Translated Blast
(6) Conserved Domain Blast (rpsblast)

3、FASTA
www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html
fasta3 用DNA序列檢索核苷酸序列，用氨基酸序列檢索蛋白質(zhì)庫(kù)。
Fastx3/fastay3 將DNA序列及其互補(bǔ)的序列通過(guò)6種讀碼框翻譯成不同的氨基酸序列檢索蛋白質(zhì)庫(kù)
注意：提交結(jié)果的形式與Blast不同（表格形式）

4、Blitz
http://www2.ebi.ac.uk/bic_sw/
能檢索出遠(yuǎn)緣的序列；發(fā)現(xiàn)家族成員上可*；只用于蛋白質(zhì)庫(kù)；慢！一般用email服務(wù)。

（三）兩序列對(duì)位排列分析
全局（貫穿整條序列長(zhǎng)度）；局部（相似性變大區(qū)段）
1、Blast 2 sequence 任兩條序列，允許空位。 blastn, blastp, tblastn(比較蛋白質(zhì)序列1與核苷酸序

列翻譯成蛋白質(zhì)序列2比較。 blastx 比較核苷酸序列（譯成蛋白質(zhì)）（seq1）和蛋白質(zhì)序列（seq2）

tblastx 兩條核苷酸比較（譯成蛋白質(zhì)） 2、Global alignment program (GAP) 兩條序列，允許空位，

可以選記分的矩陣，全局對(duì)位排列，提交有格式。 >sequence 1 ATGTGAGGTCCCTGA >sequence 2

GCTGCAAGTCGTAGC 四、多序列對(duì)位排列分析和系譜分析 主要用于分析基因或蛋白質(zhì)的進(jìn)化；通過(guò)分析各

個(gè)基因和蛋白質(zhì)序列的同源性確定它們?cè)谶M(jìn)化上的關(guān)系；分析基因或蛋白質(zhì)的功能。 1、多序列對(duì)位排列

分析（Multiple Sequence Alignment） -兩條以上序列排列分析 -可以發(fā)展保守的結(jié)構(gòu)域（重要的功能

位點(diǎn)？） -多序列允許插入空位 -Clustal W 目前公認(rèn)的最好的序列alignment的方法之一（可以下載）

對(duì)要分析的序列輸入格式有要求 FAST（Pearson）格式 >sequence 1 ATGTGAGGTCCCTGA >sequence 2

GCTGCAAGTCGTAGC -分析方法（舉例） Bayor college of medicine (BCM)生物信息學(xué)主頁(yè)

http://dot.imgen.bcm.tmc.edu Multiple sequence alignment –Clustal W 1.8-結(jié)果 [o] full

options form 修改 -可以修改分析參數(shù) 一些參數(shù)的定義： （1）Gap opening penalty 增大數(shù)值使Gap

數(shù)減??； (2) Gap extension penalty 增大數(shù)值使Gap變短； （3）Weight transition penalty A-G轉(zhuǎn)

換成C-T 轉(zhuǎn)換（multiple DNA alignment） (4) Hydrophilic gap 選“on”將增加形成gap的機(jī)會(huì)