Western Blot常見問題解析–技術(shù)篇
1.電泳中的問題
| 出現(xiàn)問題 | 原???因 |
| ︶條帶呈笑臉狀 | l凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;電泳系統(tǒng)溫度偏高 |
| ︵條帶呈皺眉狀 | l可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全 |
| 拖尾 | l樣品溶解不好 |
| 紋理（縱向條紋） | l樣品中含有不溶性顆粒 |
| 條帶偏斜 | l電極不平衡或者加樣位置偏斜 |
| 條帶兩邊擴(kuò)散 | l加樣量過多 |
2.? Western blot結(jié)果中背景高且不均勻
| 可能的原因 | 建???議 |
| 抗體濃度太高 | l一抗或二抗?jié)舛忍邥?dǎo)致高背景，降低抗體濃度 |
| 使用的封閉液不兼容 | l對比不同的封閉緩沖液 |
| 非特異性位點(diǎn)封閉不足 | l優(yōu)化封閉緩沖液，好的封閉緩沖液具有系統(tǒng)依賴性
l提高封閉液中蛋白的濃度 l優(yōu)化封閉時間和/或溫度。室溫封閉至少1 h或者4°C封閉過夜 l在封閉液中加入Tween-20，Tween-20的終濃度為0.05% |
| 封閉液中與其它蛋白發(fā)生抗體的交叉反應(yīng) | l換一種不同的封閉液
l不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉，牛奶含生物素 l交叉反應(yīng)的檢測。封閉一張干凈的膜，與抗體一起孵育，然后用超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物檢測 |
| 洗滌不充分，增加洗滌次數(shù)和使用緩沖液的體積 | l降低HRP結(jié)合物的濃度
l如果洗滌液中無Tween-20，添加Tween-20使其終濃度為0.05% |
| 膜的曝光時間過久 | l縮短印跡膜曝光到膠片的時間
l按照說明書的指示，保證膜始終是濕潤的 l用一張新膜 l保證膜完全被液體覆蓋，避免其干燥 l在孵育過程中始終進(jìn)行震蕩 l小心夾膜——損壞膜可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合 l不能空手持膜，始終帶干凈手套或用鑷子 |
| 緩沖液污染或結(jié)塊沉淀 | l制備新的緩沖液 |
| 抗體濃度太高 | l若一抗和/或二抗?jié)舛冗^高會產(chǎn)生高背景，降低抗體濃度 |
| HRP處產(chǎn)生聚集體 | l用0.2?μm過濾器過濾結(jié)合物 |
| 結(jié)合可產(chǎn)生斑點(diǎn) | l用一種新的高質(zhì)量的結(jié)合物 |
| 緩沖液中有污染 | l使用新的緩沖液
l緩沖液使用前過濾 |
| 操作設(shè)備被污染 | l保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔，無外緣污染物
l保證在轉(zhuǎn)膜后沒有凝膠留在膜上，蛋白可能黏在膠上導(dǎo)致背景 |
3.? Western blot結(jié)果中信號弱或無信號
| 可能的原因 | 建???議 |
| 蛋白未轉(zhuǎn)到膜上 | l轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用總蛋白染色劑染膠來確定轉(zhuǎn)膜效率。（注：總蛋白染色劑可能檢測不到低量的抗原。）
l確保轉(zhuǎn)膜過程中膠與膜完全接觸。 l確保轉(zhuǎn)印夾層排布正確 l確保按照膜的制造商的使用說明潤濕膜 l確保轉(zhuǎn)印部件在電印跡過程中未過熱 l使用正對照和/或分子量Marker l優(yōu)化轉(zhuǎn)印時間和電流 l確保樣品制備條件優(yōu)于蛋白印跡，為破壞樣品的抗原性。（注意：許多蛋白不能在還原狀態(tài)下進(jìn)行） |
| 蛋白未完全結(jié)合到膜上 | l在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入20%的甲醇促進(jìn)結(jié)合。低分子量的抗原可能會穿過轉(zhuǎn)印膜，需使用小孔徑的膜進(jìn)行。 |
| 抗體不足 | l增加抗體濃度?？贵w與目標(biāo)蛋白的親和力可能很小
l抗體可能失活，可用斑點(diǎn)印跡檢測其活性。 |
| 抗體濃度太高 | l使用太多一抗或二抗可能導(dǎo)致信號迅速消失，呈現(xiàn)出很弱的信號。 |
| 抗原不足 | l加入更多的蛋白進(jìn)行跑膠
l抗原被封閉液掩蔽 l試用不同的封閉液 l優(yōu)化封閉液中蛋白濃度 |
| 緩沖液中含有疊氮鈉 | l疊氮鈉是一種HRP的抑制劑，緩沖液不能使用疊氮鈉作為防腐劑 |
| 曝光時間太短 | l延長膠片的曝光時間（注意：超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物會持續(xù)發(fā)光至少6個小時） |
| 底物孵育時間太短 | l在使用超感應(yīng)底物時需進(jìn)行5分鐘的底物孵育。 |
| 底物失活 | l超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物和超感應(yīng)west膜室溫狀態(tài)下化學(xué)底物可保存至少12個月，超感應(yīng)免疫膜化學(xué)發(fā)光底物可保存至少6個月
l為衡量底物的活性，準(zhǔn)備一個小量的工作液在一個暗室內(nèi)，加入少量的HRP結(jié)合物，會觀察到綠光。如果未檢測到光，底物或HRP結(jié)合物均有可能失活 l確保兩底物無交叉污染兩種底物試劑的污染可能導(dǎo)致活性下降 |
| 膜可以修復(fù)剝離重新用探針檢測 | l在膜剝離過程中可能會有抗原損失或變性
l優(yōu)化剝離程序 l如有必要可重新用探針檢測 l避免在同一張膜上重復(fù)進(jìn)行探針檢測 |
| 在膜上消解抗原 | l封閉底物可能含有蛋白水解酶活性（如明膠） |
| 印跡膜保存時蛋白降解 | l準(zhǔn)備一張新的印跡膜 |
4.? Western blot結(jié)果中背景較高
| 可能的原因 | 建???議 |
| 膜封閉不夠 | l延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液 |
| 一抗稀釋度不適宜 | l對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度 |
| 一抗孵育的溫度偏高 | l建議4℃結(jié)合過夜 |
| 選擇的膜容易產(chǎn)生高背景 | l一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低 |
| 膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過 | l實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤 |
| 檢測時曝光時間過長 | l減少曝光時間 |
5.? Western blot結(jié)果中雜帶較多
| 可能的原因 | 建???議 |
| 目的蛋白有多個修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶 | l查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小 |
| 目的蛋白有其它剪切本 | l查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性 |
| 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 | l加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作 |
| 上樣量過高，太敏感 | l適當(dāng)減少上樣量 |
| 一抗不純 | l純化抗體 |
| 一抗或者二抗?jié)舛绕?/td> | l降低抗體濃度 |
| 一抗特異性不高 | l重新選擇或制備高特異性的抗體 |
6.? Western Blot結(jié)果中無信號或顯示信號弱
| 可能的原因 | 建???議 |
| 檢測樣本不表達(dá)目的蛋白 | l選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性 |
| 檢測樣本低表達(dá)目的蛋白 | l提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑 |
| 轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移 | l可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流 |
| 抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白 | l購買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應(yīng)蛋白 |
| 一抗孵育時間不足 | l建議4℃結(jié)合過夜 |
| 二抗與一抗不匹配 | l選擇針對一抗來源的種屬的抗體 |
| 洗膜過度 | l洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20 |
7.??其它現(xiàn)象
| 出現(xiàn)現(xiàn)象 | 產(chǎn)生原因 |
| 膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑 | l抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合 |
| 反白（條帶顯白色） | l目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕?/td> |
| 蛋白分子量偏低或偏高 | l膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠 |
8.??安全問題
| 操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。 |