Wako 299-79901 組織透明化試劑盒 SCALEVIEW-S Trial Kit
caleS技術(shù)由一組主要成分為尿素和山梨糖醇的組織透明化試劑組成。
開發(fā)此技術(shù)的理化研究所·腦神經(jīng)科學(xué)研究中心和光量子工學(xué)研究中心通過進(jìn)一步改良，研發(fā)出兼?zhèn)涑錾该鞫群涂杀Ａ艏?xì)微結(jié)構(gòu)及熒光信號的新成果。
FUJIFILM Wako取得理化研究所的許可，把此項成果商品化，推出SCALEVIEW?-S產(chǎn)品。
SCALEVIEW?-S 不僅可以透明化含有熒光蛋白的生物標(biāo)本，而且也可以有效應(yīng)用于抗體或熒光染料標(biāo)記的厚標(biāo)本。它將有望成為分析腦組織病理標(biāo)本的有力工具。
SCALEVIEW?-S Trial Kit主要由從SCALEVIEW?-S0到SCALEVIEW?-SMt等6種試劑組成，可通過使用各試劑進(jìn)行透明化的試劑盒。
數(shù)據(jù)提供：
國立研究開發(fā)法人理化學(xué)研究所
腦神經(jīng)科學(xué)研究中心細(xì)胞機(jī)能探索研究組/光量子工學(xué)研究中心生命光學(xué)技術(shù)研究組
濱裕先生、星田哲志先生、宮脇敦史先生
合作：olympus株式會社
◆SCALEVIEW?-S 組織透明化實驗報告例子
■ 小鼠大腦半球1-2 mm厚切片
（※試劑用量標(biāo)準(zhǔn)：透明化處理和固定各5 mL。）
※在組織透明化實驗中，請注意試劑的使用量、處理的時間根據(jù)樣本大小會有所改變。
此外，請盡可能在灌注固定后取出并重新固定樣本。
■ 使用SCALEVIEW?-S小鼠大腦透明化例子
從左依次是小鼠大腦切片（1mm厚）SCALEVIEW?-S處理前后和小鼠大腦半球SCALEVIEW?-S處理前后
■ 用雙光子激發(fā)顯微鏡觀察YFP-H line系小鼠透明化全腦——逐步放大基底神經(jīng)節(jié)區(qū)域
◆免疫組織染色：AbScale 實驗報告
■ 小鼠大腦半球1-2 mm厚切片
（※試劑用量標(biāo)準(zhǔn)為前處理各試劑：10 mL、抗體染色：1.5 mL、透明化：10 mL、固定：10 mL。）
* AbScale Solution : 含0.33 M 尿素、0.1 % (wt/vol) Triton X-100的PBS(-)溶液
■ 阿爾茨海默病模型小鼠（17個月）大腦切片（2mm厚）通過AbScale法進(jìn)行免疫組織染色的圖
? 像例
◆熒光染料染色：ChemScale 實驗報告
■ 小鼠大腦半球1-2 mm厚切片
（試劑用量標(biāo)準(zhǔn)為前處理各試劑：10 mL、熒光染料染色：8 mL、洗滌：10 mL、透明化：10 mL）
■ 用共聚焦激光掃描顯微鏡（倒立）觀察ChemScale處理（PI染色）后的YFP-H line小鼠大腦半球
? ? ?切片（2 mm厚）
◆SCALEVIEW?-S Neurosphere觀察示例
■ Neurosphere
（試劑用量標(biāo)準(zhǔn)：前處理及透明化各試劑1.2 mL?！贵w染色基于AbScale實驗報告）
■ 從成年大鼠海馬體制備的神經(jīng)干細(xì)胞Neurosphere三維免疫染色——使用AbScale法
組織透明化配套耗材：成像用透明室
組織透明化試劑Q&A ver1.0
Tissue clearing reagent Q&A ver1.0
Q：組織透明化的原則
Ａ：組織透明化通常是按下面的步驟進(jìn)行的：
Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脫色 （d）折射率匹配
Q：組織透明化的優(yōu)勢
Ａ：目前大多數(shù)可用的透明化技術(shù)，都是通過編碼熒光報告蛋白或者用熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行后標(biāo)記，從而可視化
Ａ：組織中特定的蛋白。組織透明化成為了具有單細(xì)胞分辨率的組織3D成像中重要的一環(huán)。
Q：透明化技術(shù)的比較
Ａ：下面是水性的透明化技術(shù)。
Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些應(yīng)用中有一定優(yōu)勢。因為SeeDB不含去垢劑，所以對于透明化DiI(細(xì)胞膜
Ａ：紅色熒光探針，一種神經(jīng)示蹤劑)標(biāo)記的樣品和使用光電關(guān)聯(lián)顯微鏡（CLEM）的情況下，SeeDB有著一定優(yōu)
Ａ：勢。另外SeeDB會產(chǎn)生自體熒光，有時候會對辨認(rèn)未標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（如神經(jīng)氈）起著一定幫助。
Ａ：SeeDB2是為使用高NA物鏡的高分辨率成像而優(yōu)化的技術(shù)；因此，當(dāng)處理較大的組織時，CLARITY或者CUBIC
Ａ：會是更好的選擇。
Q：切片厚度的最大值和最小值？
Ａ：您應(yīng)該根據(jù)您的物鏡的WD（工作距離）來決定切片的厚度。我們建議切片的厚度不要超過3mm。對于十分薄
Ａ：且脆弱的樣品，我們建議使用瓊脂糖包埋。
Ａ：使用CUBIC，可以讓全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重復(fù)性。
Q：試劑盒成分
Ａ：具體如下：
Ａ：1. SCALEVIEW-S試劑盒（299-79001）適用于20份1-2mm的切片樣品
Ａ：Ａ：1） SCALEVIEW-S0——100 mL
Ａ：Ａ：2） SCALEVIEW-S1——100 mL
Ａ：Ａ：3） SCALEVIEW-S2——100 mL
Ａ：Ａ：4） SCALEVIEW-S3——100 mL
Ａ：Ａ：5） SCALEVIEW-S4——100 mL
Ａ：Ａ：6） SCALEVIEW-SMT——100 mL
Ａ：2. SCALEVIEW-S試劑盒（290-80801）適用于20-30份1-2 mm的切片樣品。
Ａ：Ａ：1） SCaleCUBIC-1 Solution——250 mL
Ａ：Ａ：2） SCaleCUBIC-2 Solution——250 mL
Ａ：Ａ：3） Mounting Solution 1——40 mL
Ａ：Ａ：4） Mounting Solution 2——40 mL
Ａ：3. SeeDB試劑盒（299-79901）適用于20-30份1-2 mm的切片樣品。
Ａ：Ａ：1） SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：2） SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：3） SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：4） SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：5） SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：6） SeeDB——50 mL
Ａ：4. SeeDB2試劑盒（294-80701）適用于20-30份1-2 mm的切片樣品。
Ａ：Ａ：1） Saponin（皂角苷）——5 g
Ａ：Ａ：2） SeeDB2G solution——50 mL
Ａ：Ａ：3） SeeDB2S solution——50 mL
Ａ：Ａ：4） PBS——50 mL
Q：樣品的保存
Ａ：SCALEVIEW-S處理的樣品應(yīng)在室溫下保存2至3周。您可以在2至3周內(nèi)觀察SCALEVIEW-S透明化的樣品中的
Ａ：熒光信號。
Ａ：CUBIC處理的樣品應(yīng)在室溫下保存1周。您可以在1周內(nèi)觀察CUBIC透明化的樣品中的熒光信號。
Ａ：SeeDB2G處理的樣品應(yīng)在冰箱中保存1年，而SeeDB2S處理的樣品則可在室溫下保存1年。您可以在1年內(nèi)觀
Ａ：察SeeDB透明化的樣品中的熒光信號。
Q：抗體的熒光標(biāo)記
Ａ：應(yīng)在進(jìn)行透明化前就進(jìn)行抗體的熒光標(biāo)記。
Q：適用于SCALEVIEW-S的顯微鏡
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Q：適用于CUBIC的顯微鏡
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）
Q：適用于SeeDB2的顯微鏡
Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸鏡頭）
Ａ：STED（Leica Microsystems）
Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）
Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）
Ａ：Two-photon（最好使用復(fù)合浸沒鏡頭）
Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸鏡頭）
Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制鏡面的設(shè)備）
Q：重構(gòu)
Ａ：對于定量用途，我們建議使用Neurolucida系統(tǒng)（MBF）。我們同樣測試了VAST Lite用于成像用途時的表
Ａ：現(xiàn)。重構(gòu)時也可以使用開源軟件。例如，Vaa3d可以處理大量的拼接圖像的數(shù)據(jù)。
Q：物鏡推薦
Q：其他物種？其他器官？
Ａ：對于昆蟲樣品和魚類樣品，建議選擇CUBIC。
Ａ：昆蟲相關(guān)文獻(xiàn)：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
Ａ：魚類相關(guān)文獻(xiàn)：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).
對于多細(xì)胞球狀體，選擇SCALEVIEW-S會更好。
https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0