DEAE-纖維素 DE-52 使用說明
DEAE-纖維素(52)
使用說明書
簡介
DEAE-纖維素，它采用平均粒徑為50μm的顆粒型親水高分子聚合物，表面又用大
分子糖鏈接枝，使它有更高的比表面積和更好的生物兼容性，它在高流水下保持
更高載量，同時又具有更好的分辨率。由于比表面積大，平衡和洗脫的時間也更.
短。它經(jīng)過接枝即使是純化病毒，質(zhì)粒等超大分子的物質(zhì)，載量基本保持不變。
關(guān)于DEAE52纖維素的處理只有簡單的幾步，如下:
1.先將干粉的纖維素浸泡在蒸餾水中，一段時間大約3小時左右，我偏愛這個時間，去除雜質(zhì)，最好抽干一下；
2.再用0.5mol/l的HCl溶液浸泡2小時，用去離子水洗凈至PH中性，并抽干；
3.將抽干的纖維素再浸泡在0.5mol/l的NaOH溶液中2小時，用去離子水洗至中性，抽干。即可用了
對于用過的纖維素，可以重復(fù)利用多次，但需要經(jīng)過再生處理后才可以使用。再生處理可先用高濃度NaCl (1－2 mol/L)過柱沖洗柱床，以除去DEAE－52陰離子交換纖維所吸附的成份。然后，再用0.5 mol/L的HCl和NaOH處理，處理方法與預(yù)處理完全相同。
DEAE－纖維素的處理及裝柱
（1）處理
本實驗采用的是DEAE－纖維素DE 52 是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達(dá)到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001M?EDTA)，預(yù)先將DE-52柱進(jìn)行平衡。
DEAE—纖維素的活化
稱取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸餾水浸泡過夜，觀察溶脹后DEAE的體積。根據(jù)所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細(xì)小顆粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。本實驗中在用前應(yīng)以0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡后使用。
DEAE—纖維素的再生
用過的離子交換劑可以反復(fù)使用，使其恢復(fù)原狀的方法俗稱“再生”。再生并非每次用酸、堿反復(fù)處理，通常只要“轉(zhuǎn)型”處理即可。所謂轉(zhuǎn)型就是使交換劑帶上所希望的某種離子，如希望陽離子交換劑帶上NH+4則可用NH4OH浸泡，如希望陰離子交換劑帶上Cl—則用NaCl溶液處理。本實驗中DEAE—纖維素在酸堿處理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖溶液浸泡即可轉(zhuǎn)型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纖維素使用后因帶有大量雜蛋白，所以再生時，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用去離子水洗至pH8左右，再轉(zhuǎn)型，即可再使用。
三、應(yīng)用的注意事項:
1)色譜柱裝填
1、所需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,液體最好做脫氣處理。
填料可直接稱量需要的量用緩沖液溶漲一小時裝柱即可.
2、在柱子下端加入20%乙醇，以除去柱子中的空氣，關(guān)閉柱子出口，在柱
內(nèi)保留少量的20%乙醇。20%乙醇容易產(chǎn)生氣泡，可以在里面加1%吐溫避免氣泡產(chǎn)生。也可以換成純水裝柱子，但是需要把填料中的20%乙醇也換成純水，具體
的方法取需要體積的填料在抽濾漏斗上進(jìn)行，也可以小心傾去填料上的20%乙
醇，再換成5倍體積的純水，反復(fù)沉淀去上清，5次左右就可以用于裝柱子。
3、此填料顆粒比較細(xì)，所以一定 要注意柱子要選擇合適的篩網(wǎng)，不能漏，
也可以取點填料加到篩網(wǎng).上試試，如果沒有問題再將填料連續(xù)倒入柱子時，要用
玻璃棒的緊靠柱子內(nèi)壁引流，以減少氣泡的產(chǎn)生，讓填料先自然沉降到填料體積
不再變化，而填料和上面的液體很好分層，上層溶液完全澄清，就可以開泵用適
當(dāng)?shù)牧魉賶褐?，填料體積不再變化后，再把轉(zhuǎn)換頭緊頂在填料上就可以平衡柱
子使用。使用的流速要小于裝柱子的流速。
4、在裝柱子前，填料從冰箱中取出至少要室溫放置2-3個小時，這樣避免
裝柱子時由于溫度變化而使柱子中產(chǎn)生氣泡。
2)蛋白的結(jié)合
樣品的鹽濃度和pH要盡量和平衡柱子的緩沖液-致,鹽濃度過高或者pH帶
低也許掛不上，所以要根據(jù)自己的樣品做適當(dāng)調(diào)整。
3)蛋白的洗脫
這個填料如果采用線性梯度洗脫，柱子的直徑和高度比最好是大于10,數(shù)值
越大越有利于分離，而且樣品最好別上太多，可以按約10mg/ml.上樣，如果采用
階段洗脫的方法，裝短粗柱子就可以，上樣量也沒有限制。階段洗脫容易放大，
重復(fù)性好，如果洗脫條件好完全可以得到和線性梯度一樣或者更好。采用什么方
法完全根據(jù)自己需要。
四、再生清洗
1、每次用完最好用含2M NaCl洗5個床體積，再用水洗5個柱床體積，然后用
20%乙醇保存，使用3-5次后在水洗之后再用70%的乙醇或30%異丙醇都含1%吐
溫洗5個柱床體積，最后20%的乙醇流洗5個柱床體積。
2、有機(jī)溶劑和水混合很容易產(chǎn)生氣泡，為了避免這樣情況，可以把配好的有
機(jī)溶劑在室溫放置過夜，再使用，這樣可以避免氣泡進(jìn)柱子而導(dǎo)致柱子不能正常
使用。
五、保存
在20%乙醇中，4’C下長期保存。