默克西格瑪用于細(xì)胞追蹤的親脂性染料試劑盒系列

發(fā)表于由

細(xì)胞類型 最終細(xì)胞濃度 最終染料濃度
hPBMC *（高細(xì)胞數(shù)） 1 x 107細(xì)胞/mL
3 x 107細(xì)胞/mL 5 x 107細(xì)胞/mL 2 μM?PKH67
4 μM?CellVue??Claret
5 μM?CellVue Claret
hPBMC *（低細(xì)胞數(shù)） 5 x 106細(xì)胞/mL 1 x 106細(xì)胞/mL 2 μM?PKH26
1 μM?CellVue Claret
培養(yǎng)的細(xì)胞系 1 x 107細(xì)胞/mL
1 x 107細(xì)胞/mL 1 x 107細(xì)胞/mL 1 x 107細(xì)胞/mL 1 x 107細(xì)胞/mL 15 μM?PKH26 (U937)
12.5-15 μM PKH26 (U937) 1 μM PKH67 (K562) 1 μM PKH67 （多克隆T細(xì)胞系） 10 μM CellVue Claret (YAC-1)
* 使用Ficoll / Hypaque后低速洗滌（300 x?g）以將血小板污染降至最低

表S1.選定細(xì)胞類型的非擾動膜染料標(biāo)記條件1

1?改編自：Tario Jr.等人 (2011) 的表1；經(jīng)Humana出版社許可轉(zhuǎn)載。首次發(fā)表于Methods in Mol.Biology, 699, 119 (2011).

Dye PKH67 PKH26 CellVue??Claret
發(fā)射 綠色（最大502nm） 橙紅色（最大567nm） 遠(yuǎn)紅（最大675nm）
有用的激光線 457nm, 488nm 488nm, 514nm, 543nm 633-635nm, 647nm
光譜兼容2 Hoechst 33342, PE, Cy 3, TR, PI, 某些紅FP, PE-Cy5, PerCP, 7-AAD, APC, TO-PRO-3, DRAQ5, PE-Cy7, APC-Cy7 Hoechst 33342, FITC, CFSE, 綠FP, TR, PI, 某些紅FP, PE-Cy5, 7-AAD, APC, TO-PRO-3, DRAQ5, PE-Cy7, APC-Cy7 Hoechst 33342, FITC, CFSE, 綠/黃FP, PE, Cy 3, PE-Cy5, PI, TR, 某些遠(yuǎn)紅FP, PerCP, 7-AAD, PE-Cy7, APC-Cy7
不適合配用2 FITC, CFSE, 綠/黃FP PE, Cy3, TR, PerCP, 某些黃/紅FP3 某些紅/遠(yuǎn)紅FP,3 APC, Cy5, DRAQ5, TO-PRO-3
共培養(yǎng)中的染料轉(zhuǎn)移 最少4 最少 最少
體內(nèi)非分裂細(xì)胞中達(dá)到50％強(qiáng)度的時間 10-12 天 100-200 天 尚不清楚（體外研究表明它與PKH26相似）
一般細(xì)胞追蹤應(yīng)用（典型時間范圍） 體外和體內(nèi)5（數(shù)天至數(shù)周） 體外和體內(nèi)5（數(shù)天至數(shù)周） 體外6和體內(nèi)
（最大值不知道）
細(xì)胞增殖監(jiān)測 是5?(8-10代) 是5
(8-10代) 與標(biāo)準(zhǔn)追蹤染料（例如PKH26和CFSE）相當(dāng)7
細(xì)胞接頭試劑盒配置 PKH67GL-1KTL8
MIDI67-1KT9
MINI67-1KT10 PKH26GL-1KT8
MINI26-1KT10
PKH26PCL-1KT11 MIDCLARET-1KT9
MINCLARET-1KT10
表S2.選擇用于細(xì)胞追蹤和增殖監(jiān)測的膜染料試劑盒1

縮寫：APC = 別藻藍(lán)蛋白; 7-AAD = 7-氨基放線菌素D; CFSE = 羧基熒光素琥珀酰亞胺酯; Cy3 = 花青3; Cy5 = 花青5; Cy7 = 花青7; FP = 熒光蛋白; PE = 藻紅蛋白; PI =碘化丙錠; PerCP = 多甲藻素葉綠素 l 蛋白; TR =Texas Red（德克薩斯紅）*

* CellVue是PTI Research, Inc.的商標(biāo)。CY是Cytiva Healthcare的商標(biāo)。Texas Red和TO-PRO-3是Molecular Probes的商標(biāo)。DRAQ5是Biostatus Ltd.的商標(biāo)。

1?詳情參見參考文獻(xiàn)1-4和11。PKH26最初是在1980年代后期由Paul Karl Horan及其同事在Zynaxis Cell Science開發(fā)的，我們從1993年和1997年便開始銷售PKH26和PKH67。CellVue Claret，一種由PTI Research, Inc.開發(fā)的遠(yuǎn)紅類似物，于2008年加入了我們的細(xì)胞追蹤家族。
2?光譜的兼容和不兼容是具有代表性而非窮舉性的，它們假定激光激發(fā)點在空間上是分開而非一致的。來自不同熒光探針的相對信號隨目標(biāo)生物系統(tǒng)的不同而不同。每個用戶必須運行必要的對照來檢驗在其自己系統(tǒng)中的兼容性。
3?Shcherbo D, Merzylak EM, Chepurnykh TV et al. Bright Far-red Fluorescent Protein for Whole-body Imaging.Nature Meth.4:741-746 (2007).
4?當(dāng)FBS或其他蛋白質(zhì)在染色方案中用作“終止”試劑時，24小時時 < 0.3%（見文本）。 5 對于PKH染料應(yīng)用的部分參考書目（1988-2006），見表1和表2。 6?詳情參見參考文獻(xiàn)3、8、9、12和20。 7?詳情參見參考文獻(xiàn)3和11。 8?GL試劑盒含有0.5 mL染料+ 6x10 mL稀釋劑C（推薦用于大規(guī)?；蝮w內(nèi)研究中細(xì)胞的一般膜標(biāo)記）。 9 MIDI試劑盒含有2x0.1 mL染料+ 6x10mL稀釋劑C（推薦用于體外增殖或細(xì)胞毒性研究中細(xì)胞的一般膜標(biāo)記）。 10 MINI試劑盒含有0.1 mL染料 + 1x10 mL稀釋劑C（推薦用于小規(guī)?；虺醪襟w外研究中細(xì)胞的一般膜標(biāo)記）。 11 PCL試劑盒含有0.5 mL染料 + 6x10 mL稀釋劑B（推薦用于體外或體內(nèi)研究中，在非吞噬細(xì)胞存在下，選擇性標(biāo)記吞噬細(xì)胞）。 圖S1.染色機(jī)制 PKH和CellVue染料是具有熒光“頭部基團(tuán)”和長脂肪族“拖尾”的脂質(zhì)樣分子（未按比例顯示）。在含鹽緩沖液或培養(yǎng)基中，它們迅速形成膠束或聚集體，對于非吞噬細(xì)胞具有較差的細(xì)胞標(biāo)記效率。稀釋劑C（是我們的通用膜標(biāo)記試劑盒中所含的等滲無鹽、無溶劑染色載體）使染料溶解度最大化，并促進(jìn)近乎瞬時分配到脂質(zhì)雙層中。與周圍脂質(zhì)拖尾的強(qiáng)有力的非共價相互作用，對非分裂細(xì)胞具有長期染料保留能力和穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度。 經(jīng)John Wiley & Sons, Inc.許可轉(zhuǎn)載。首次發(fā)表于Cytometry, 73A.1019 (2008). 圖S2.PKH26、PKH67和CellVue Claret的一般膜標(biāo)記方案 當(dāng)使用我們的細(xì)胞接頭試劑盒中所含的無鹽稀釋劑C載體以最大化染色效率和均一性時，這些高度親脂性染料在與細(xì)胞混合時幾乎立即分配到細(xì)胞膜中。如該示意圖中用PKH67標(biāo)記的情況，通過以下方法能最容易獲得明亮、均勻和可再現(xiàn)的染色：1）最大限度地減少染色步驟中的含鹽量，以及2）確保細(xì)胞在染料中的快速均勻分散。（如需詳細(xì)的方法和染色試驗方案，可參見參考文獻(xiàn)2和3以及表S2中包含的單個產(chǎn)品公告鏈接。） 圖S3.靶群體的色碼使得能夠同時比較體內(nèi)CTL細(xì)胞毒性與單個小鼠中的多個表位 未加標(biāo)的脾細(xì)胞，或者用4種免疫原性MHV-68肽中的1種在37℃下加標(biāo)1小時后的脾細(xì)胞，用3種不同的細(xì)胞追蹤染料中不同的1色或2色組合進(jìn)行標(biāo)記。用CMTMR單染色鑒定未加標(biāo)的脾細(xì)胞，而加標(biāo)肽的脾細(xì)胞用CellVue Claret和CFSE的組合標(biāo)記。然后將5個標(biāo)記的靶標(biāo)群體以相同的數(shù)量混合，注射到健康小鼠以及10天前感染了MHV-68病毒的小鼠（每組3只），在注射4小時后收獲脾臟。在紅細(xì)胞裂解后，用流式細(xì)胞儀評估每個群體中存活靶標(biāo)的頻率，使用光散射選通排除碎片和聚集物以及7-AAD攝取以排除無活性細(xì)胞。[注意：盡管此處顯示的肽是抗病毒疫苗的候選表位，但類似的策略可用于鑒定有效的抗腫瘤疫苗成分。] A. 代表性的兩色圖，顯示用于鑒定用每種肽加標(biāo)的靶群體的追蹤染料組合（僅用CMTMR：無肽；CFSEhi?CellVue Claretneg：ORF61p；CFSElo?CellVue Claretneg：ORF6p；CFSEneg?CellVue Claretpos：ORF9p；CFSEhi?CellVue Claretpos： B8Rp）。 B. 代表性單色直方圖，用于確定消滅的表位特異性。左圖：CMTMR選通的。中圖：CellVue Claretneg靶標(biāo)的CFSE分布。右圖：CellVue Claretpos靶標(biāo)的CFSE分布）。下圖中的值表示特異性裂解百分比，基于在感染動物與未感染動物中觀察到的成活靶標(biāo)的頻率變化計算而得（詳見參考文獻(xiàn)9）。 經(jīng)Informa Healthcare許可重印.首先發(fā)表于Immunol. Invest.36, 829 (2007)。 材料? 產(chǎn)品編號? 說明 MIDCLARET ? ?用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記的CellVue?深紅色熒光細(xì)胞連接子Midi試劑盒Distributed for Phanos Technologies? ? ?? MINCLARET ? ?CellVue?Claret 遠(yuǎn)紅外熒光細(xì)胞交聯(lián)劑 Midi 試劑盒，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記Distributed for Phanos Technologies? ? ? PKH26GL ? ?用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記的PKH26紅色熒光細(xì)胞連接子試劑盒Distributed for Phanos Technologies? ? PKH26PCL ? ?PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit，用于吞噬細(xì)胞標(biāo)記Distributed for Phanos Technologies? ? MINI26 ? ?PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記Distributed for Phanos Technologies? ?? PKH67GL ? ?PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記Distributed for Phanos Technologies? ?? PKH67GL ? ?PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記Distributed for Phanos Technologies? ?? MINI67 ? ?PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記Distributed for Phanos Technologies? ? ? 參考文獻(xiàn) 1. 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