潮霉素B 50mg/ml(無(wú)菌）品牌：JinPan | 貨號(hào)：JP-8418-10ml
Hygromycin B solution 50mg/ml 10ml
【保存條件】
4℃保存，一年有效
【概述】
潮霉素 B 是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，可通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成來(lái)對(duì)抗細(xì)菌，真菌和高級(jí)真核生物。潮霉素 B
最初是作為抗蠕蟲(chóng)藥開(kāi)發(fā)的，在研究實(shí)驗(yàn)室中主要用于選擇和維持帶有潮霉素抗性基因的細(xì)胞。
【操作方法】
1. 常用篩選濃度
注意：潮霉素 B 用來(lái)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化，
推薦使用濃度為 50-1000μg/mL。對(duì)于第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)建立殺滅曲線(xiàn)（
kill curve），即劑量
反應(yīng)性曲線(xiàn)，來(lái)確定最佳篩選濃度。
一般而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞 50-500μg/mL；細(xì)菌/植物細(xì)胞 20-200μg/mL；真菌 300-1000μg/mL。
2. 殺滅曲線(xiàn)的建立
注意：為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，
可通過(guò)建立殺滅曲線(xiàn)（劑量反應(yīng)曲線(xiàn)）來(lái)實(shí)現(xiàn)，至少選擇 5 個(gè)濃度。
1）第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照 20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2 培養(yǎng)過(guò)夜；注：對(duì)于
需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。
2）根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定 50，100，250，500，750，
1000μg/mL。先用去離子水或者 PBS buffer 按照 1:10 的比例將母液稀釋到 5 mg/ml，然后按照下表稀釋到相
應(yīng)濃度的工作液。
3）第二天：替換舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。
4）接下來(lái)每 3-4 天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5）按照固定的周期（如每 2 天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天
數(shù)（通常是 7-10 天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
3. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選
1）轉(zhuǎn)染 48h 后，用含有適當(dāng)濃度的潮霉素 B 篩選培養(yǎng)基來(lái)傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
注意：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。則當(dāng)細(xì)胞過(guò)于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較
好的篩選效果，最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過(guò) 25%。
2）每隔 3-4 天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
3）篩選 7 天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這
取決于宿主細(xì)胞類(lèi)型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。
4）挑取并轉(zhuǎn)移 5-10 個(gè)抗性克隆于 35mm 細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng) 7 天。
5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
【注意事項(xiàng)】
1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2. 本品為有毒化合物，避免與皮膚和眼睛接觸，請(qǐng)小心操作。
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