動物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒（單柱法）250T品牌：JinPan | 貨號：EK-1303-250T
產(chǎn)品介紹
本試劑盒可以快速地從動物細(xì)胞中提取總 RNA。其提取的總 RNA 純度高（存在基因組 DNA），
無蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)污染，可用于 RT-PCR、qPCR、cDNA 合成、引物延伸、芯片分析、Northern Blot、
Dot Blot、Slot Blot、Poly A 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析和分子克隆等多種下游實驗。本產(chǎn)品僅供
科研使用，請勿用于醫(yī)藥、臨床治療、食品級化妝品等用途。
存儲條件
Buffer RLT 可室溫（15℃-25℃）干燥放置至少一年，加入 β-巰基乙醇的 Buffer RLT 可 4℃放置一個
月；其他試劑室溫干燥保存可至少穩(wěn)定 12 個月。
需要額外準(zhǔn)備的材料
? 14.3 M β-巰基乙醇(β-ME) (常規(guī)購買商業(yè)化商品即為 14.3 M)
? 70%乙醇：RNase-free 水配制
? 無水乙醇（96%-100%）
? 無 RNase 酶的 1.5ml 離心管
? 無 RNase 酶的槍頭
? 干凈的手套
? 高速離心機(jī)
? 物理研磨設(shè)備
開始前注意事項 請務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
? 操作前在 Buffer RLT 中加入 β-巰基乙醇（
β-ME）至終濃度為 1%（建議現(xiàn)配現(xiàn)用），如 1 ml Buffer RLT
中加入 10μl β-巰基乙醇。配好的 Buffer RLT 可在 4℃維持穩(wěn)定一個月。
? Buffer RLT 在儲存時可能會形成沉淀， 如果有沉淀出現(xiàn)，請 37℃加熱溶解后室溫使用。
? Buffer RW1 作為濃縮液提供，在第一次使用前加入 0.25 倍體積的乙醇（96-100％）以獲得工作溶液。
? Buffer RPE 作為濃縮液提供，在第一次使用前加入 4 倍體積的乙醇（96-100％）以獲得工作溶液。
? RNase-free 水中不含任何抑菌因子，室溫放置或操作時可能會引入細(xì)菌或真菌污染，使用時盡量注意，
推薦開瓶后分裝保存以減少污染風(fēng)險保證實驗穩(wěn)定性。
? RNA 在 Buffer RLT 中時不會被 RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含 RNase 的無酶離心
管或玻璃器皿。
操作步驟：
1.
請根據(jù)樣品種類進(jìn)行以下步驟（1a 為動物細(xì)胞，1b 為動物組織）
1a. 收集動物細(xì)胞：懸浮細(xì)胞可直接 300×g 離心 5min 并仔細(xì)吸除上清留沉淀待使用；
單層貼壁細(xì)胞可通過直接裂解法（吸盡培養(yǎng)基留下貼壁細(xì)胞，待步驟 2 用 Buffer
RLT 裂解）或胰酶處理法（吸盡培養(yǎng)基留下貼壁細(xì)胞，用 PBS 清洗細(xì)胞，吸除 PBS
后使用含 0.10%-0.25%胰酶的 PBS 使細(xì)胞脫落，加入含有血清的培養(yǎng)基使胰酶失
活后轉(zhuǎn)入 1.5ml 無酶離心管中 300×g 離心 5min，吸除上清留沉淀待使用）
注意：收集細(xì)胞數(shù)量不要超過 1×107，收集細(xì)胞時一定要將細(xì)胞培養(yǎng)基去除干凈，否則會導(dǎo)致步驟 2 時細(xì)胞裂解
不完全，影響 RNA 與吸附柱的結(jié)合，導(dǎo)致 RNA 的產(chǎn)量降低。
2b. 動物組織勻漿裂解處理：
將 10mg-30mg 動物組織轉(zhuǎn)移入 1.5ml 無酶離心管中并加
入 600μl Buffer RLT（動物組織量不要超過 30mg）使用前請檢查 Buffer RLT 是否
加入 β-巰基乙醇，使用研磨杵或電動研磨機(jī)將動物組織徹底研磨勻漿。直接進(jìn)行
步驟 3.
勻漿時間根據(jù)樣本裂解難易程度決定，亦可勻漿后靜置 3-5min 延長裂解時間（期間顛倒吹勻 2-3 次）。
2.
樣品裂解：對于1a中使用直接裂解法的細(xì)胞應(yīng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中直接加入600μl
Buffer RLT（使用前請檢查 Buffer RLT 是否加入 β-巰基乙醇）進(jìn)行細(xì)胞裂解，之
后將裂解液全部吸入 1.5ml 無酶離心管中進(jìn)行下一步操作。對于 1a 中使用胰酶處
理法的細(xì)胞應(yīng)在無酶離心管中加入 600μl Buffer RLT 渦旋 1min 裂解并進(jìn)行下一
步操作
若細(xì)胞量少于 5×106 可使用 350μl Buffer RLT。若細(xì)胞量較大，可渦旋后靜置 3-5min 延長裂解時間（期間顛倒吹
勻 2-3 次）。
3.
將無酶離心管放入高速離心機(jī)以最大轉(zhuǎn)速(~13,400×g)離心 3min。收集上清入新的
1.5ml 無酶離心管中，并加入 1 倍體積的 70%乙醇混勻。如 600μl 溶液則加入 600μl
70%乙醇。
配制 70%乙醇時請使用 RNase-free water。
4.
將步驟 3 混勻后的溶液轉(zhuǎn)移入 RNase-free 吸附柱中并套上 2ml 收集管，
≥8000×g(≥10,000 rpm)離心 30s，棄廢液。
吸附柱最大上柱量為 700μl，若溶液過多可分多次上柱。后續(xù)操作若無特殊說明吸附柱均置于 2ml 收集管中。
5.
向吸附柱中加入 700μl Buffer RW1（使用前請確認(rèn) Buffer RW1 是否按要求加入
0.25 倍體積無水乙醇）, ≥8000×g(≥10,000 rpm)離心 30s，棄廢液。
6.
向吸附柱中加入 500μl Buffer RPE（使用前請確認(rèn) Buffer RPE 是否按要求加入 4
倍體積無水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)離心 30s，棄廢液。
7.
重復(fù)步驟 6 一次。
8.
倒棄濾液，將吸附柱放入收集管中, 以最大轉(zhuǎn)速(~13,400×g)離心 3min 干燥柱膜。
9.
將吸附柱套入新的無酶 1.5ml 離心管管中，并置于無酶的環(huán)境中開蓋靜置 5-10min
至乙醇晾干。
若吸附柱中殘留乙醇將會對純化后的 RNA 的下游實驗造成影響。
10. 向吸附柱膜正中央加入 50-100μl RNase-free Water，蓋上蓋子室溫靜置 3-5 min。
后置于離心機(jī)中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 離心 3min 得到 RNA 溶液。
RNA 洗脫體積不應(yīng)少于 30μl，否則影響洗脫效率。洗脫后的 RNA 溶液應(yīng)置于-80℃儲存。
RNA 純度及濃度檢測
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的 RNA，OD260/OD280 讀數(shù)在 1.8-2.1
之間，比值為 2.0 是高質(zhì)量 RNA 的標(biāo)志。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的 pH 值影響。同一
個 RNA 樣品，假定在 10 mM Tris pH7.5 溶液中測出的 OD260/OD280 讀數(shù) 1.8-2.1 之間，在水溶液
中所測讀數(shù)則可能在 1.5-1.9 之間，但這并不表示 RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free ddH2O 稀釋 n 倍，用 RNase-free ddH2O 將分光光度計
調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行 OD260, OD280 測定，按照以下公式進(jìn)行 RNA 濃度的計算：
終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù) n)×40
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