細胞質(zhì)與細胞核RNA小量提取試劑盒250T品牌：JinPan | 貨號：EK-1315-250T
FastPure Cytoplasmic & Nuclear RNA purification Kit HandBook
FastPure 細胞質(zhì)和細胞核 RNA 小量提取試劑盒說明書
產(chǎn)品組成
產(chǎn)品介紹
本試劑盒可以快速地從哺乳動物細胞或組織中提取細胞質(zhì)或細胞核 RNA，不含酚氯仿等有毒試劑。
其提取的總 RNA 純度高，無蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)污染，可用于 RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA 差異
顯示、分子克隆等多種下游實驗。本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于醫(yī)藥、臨床治療、食品級化妝品等用
途。
存儲條件
Buffer RN 置于 2-8℃保存；Buffer RT 可室溫（15℃-25℃）干燥放置至少一年，加入 β-巰基乙醇（或
DTT）的 Buffer RT 可室溫放置一個月；其他試劑室溫干燥保存可至少穩(wěn)定 12 個月。
需要額外準備的材料
? 14.3 M β-巰基乙醇(β-ME) (常規(guī)購買商業(yè)化商品即為 14.3 M)或 2M DTT
? 70%乙醇：RNase-Free 水配制
? 無水乙醇（96%-100%）
? 無酶 1.5ml 離心管
? 無酶吸頭
? 干凈的手套
? 高速離心機
? 物理研磨設備
開始前注意事項 請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
? 操作前在 Buffer RT 中加入 β-巰基乙醇（
β-ME）至終濃度為 1%（建議現(xiàn)配現(xiàn)用），如 1 ml Buffer RT
中加入 10μl β-巰基乙醇(或加入 20 μl 的 2 M DTT)。配好的 Buffer RT 可在 4℃維持穩(wěn)定一個月。
? Buffer RT 在儲存時可能會形成沉淀，如果有沉淀出現(xiàn)，請 37℃加熱溶解后室溫使用。
? Buffer RW1 作為濃縮液提供，在第一次使用前加入 0.25 倍體積的乙醇（96-100％）以獲得工作溶液。
? Buffer RPE 作為濃縮液提供，在第一次使用前加入 4 倍體積的乙醇（96-100％）以獲得工作溶液。
? 如果執(zhí)行可選的柱上 DNA 酶消化步驟，請制備 DNase I 儲備液：將 DNase I 干粉（1500 U）溶解在
550μl RNase-Free ddH2O 中，輕柔混勻（禁止渦旋），分裝后-20℃貯存（可保存 9 個月）。
? RNase-free 水中不含任何抑菌因子，室溫放置或操作時可能會引入細菌或真菌污染，使用時盡量注意，
推薦開瓶后分裝保存以減少污染風險保證實驗穩(wěn)定性。
? RNA 在 Buffer RT 中時不會被 RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含 RNase 的離心管或玻
璃器皿。
? RNA 提取操作及離心過程常溫進行即可。
操作步驟：
1.請根據(jù)樣品種類進行以下步驟（1a 為動物細胞，1b 為動物組織）
1a. 收集動物細胞： 懸浮細胞可直接 300×g 離心 5min 并仔細吸除上清留沉淀待使用；
單層貼壁細胞可通過直接裂解法（吸盡培養(yǎng)基留下貼壁細胞，待步驟 2 用 Buffer RT
裂解）或胰酶處理法（吸盡培養(yǎng)基留下貼壁細胞，用 PBS 清洗細胞，吸除 PBS 后
使用含 0.10%-0.25%胰酶的 PBS 使細胞脫落，加入含有血清的培養(yǎng)基使胰酶失活后
轉(zhuǎn)入無酶 1.5ml 離心管中 300×g 離心 5min，吸除上清留沉淀待使用）
注意：收集細胞數(shù)量不要超過 1×107，收集細胞時一定要將細胞培養(yǎng)基去除干凈，否則會導致步驟 2 時細胞裂解
不完全，影響 RNA 與吸附柱的結(jié)合，RNA 的產(chǎn)量降低。
1b. 動物組織勻漿處理： 將 10mg-30mg 動物組織轉(zhuǎn)移入無酶 1.5ml 離心管中并加入
600μl Buffer RT（動物組織量不要超過 30mg）使用前請檢查 Buffer RT 是否加入 β-
巰基乙醇，使用研磨杵或電動研磨機將動物組織徹底研磨勻漿。直接進行步驟 3.
2.加入 4℃預冷的 180μl Buffer RN 至細胞沉淀中，并于冰上孵育 5min。對于未消
化收集的培養(yǎng)在 3.5cm 培養(yǎng)皿中的細胞，可吸凈培養(yǎng)基用 PBS 清洗一次后，直接
加入 4℃預冷的 180μl Buffer RN 至細胞培養(yǎng)皿中，然后用細胞刮刀輕輕刮動并轉(zhuǎn)
移至無酶 1.5ml 離心管中，并于冰上孵育 5min。
對于提前離心沉淀在離心管中的細胞，通過輕彈離心管以使細胞沉淀徹底分散開。懸浮液應迅速澄清，表明質(zhì)膜
立即溶解。注意：細胞沉淀的不完全分散可能導致裂解效率低下和 RNA 產(chǎn)量降低。
3.將上述裂解物在 4oC 下以 300×g 離心 2min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的無酶 1.5ml 離心
管中用于細胞質(zhì) RNA 提取，沉淀用于細胞核 RNA 提取。如果在此過程的后續(xù)步
驟中使用相同的離心機，則保持離心室溫狀態(tài)。
上清液含有細胞質(zhì)提取物。根據(jù)細胞類型的不同，它通常略帶混濁和黃白色。沉淀含有細胞核，上清中為細胞質(zhì)裂解物。
4.于步驟 3 種所得細胞質(zhì)裂解物及細胞沉淀管中分別加入 600 μl Buffer RT（使用前
請檢查 Buffer RT 是否加入 β-巰基乙醇或 DTT），充分渦旋混勻。
若沉淀物較多，可室溫裂解 3-5min，期間搖勻 2-3 次
5.將 430μl 無水乙醇（96–100％）分別加入兩管裂解物中，并用移液器將其充分混
合。 不要離心。
注意：從某些細胞系純化 RNA 時，加入乙醇后可能會出現(xiàn)沉淀。 這不會影響后續(xù)提取過程。
6.將步驟 5 混勻后的兩管溶液轉(zhuǎn)移入無酶吸附柱中并套上 2ml 收集管，≥8000×g
（≥10,000rpm）離心 1min，棄廢液，直至將溶液全部轉(zhuǎn)移完成吸附。
吸附柱最大上柱量為 700μl，若溶液過多可分多次上柱。后續(xù)操作若無特殊說明吸附柱均置于 2ml 收集管中。
7.（可選步驟） 向吸附柱中央加入 80μl DNase Ⅰ 工作液，室溫（15℃-25℃）靜置
15min。配制 DNase Ⅰ 工作液： 取 10μl DNase Ⅰ儲備液入新的 RNase-Free 離心
管中，并加入 70μl Buffer RDD，輕柔混勻。
注意：DNase Ⅰ 對物理變性特別敏感，所以混勻時請上下倒置輕柔混勻，切勿渦旋。請確認 DNase Ⅰ 工作液加入
到正中央的柱膜上，否則 DNase 消化效果會不理想。
8.向兩個吸附柱中分別加入 700μl Buffer RW1，≥8000×g(≥10,000 rpm) 離心 30s，
棄廢液。
9.將兩個吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入 500μl Buffer RPE（使用前請
確認 Buffer RPE 按要求加入 4 倍體積無水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 離心
30s，棄廢液。
注意區(qū)分細胞質(zhì)與細胞核 RNA 的吸附柱
10. 重復步驟 9 一次。
11. 倒棄濾液，將吸附柱放入收集管中, 以最大轉(zhuǎn)速(~13,400×g)離心 3min 干燥柱子。
12. 將兩個吸附柱分別套入新的 RNase-Free 的 1.5ml 離心管中，并置于無 RNA 酶的
環(huán)境中開蓋靜置 5-10min 至乙醇晾干。
若吸附柱中殘留乙醇將會對純化后的 RNA 的下游實驗造成影響。
13. 向兩個吸附柱膜正中央分別加入 30-50μl RNase-Free Water，蓋上蓋子室溫靜置
3-5 min。后置于離心機中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 離心 3min 得到 RNA 溶液。
RNA 洗脫體積不應少于 30μl，否則影響洗脫效率。洗脫后的 RNA 溶液應置于-80℃儲存。
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