植物總RNA提取試劑盒品牌：genefist | 貨號(hào)：TR02 
儲(chǔ)存條件
“裂解液RS” 和 “DNase I（DNase I 凍干粉溶解于專用保存液）”，儲(chǔ)存于-20℃。其他試劑室溫（15-25℃）保存。
產(chǎn)品簡介
由于植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝活性在物種、組織類型和發(fā)育階段之間可能存在顯著差異，因此沒有一種通用的裂解溶液或獨(dú)特的方法可以同樣適用于所有植物樣品。本試劑盒包含兩種可供選擇的裂解緩沖液系統(tǒng)：裂解緩沖液 RL（含硫氰酸胍）和裂解緩沖液 RS(含 SDS/抗氧化劑)，適用于各種植物和真菌樣品。“裂解液RL”含硫氰酸胍，此提取方案適用于大部分的植物組織，操作簡單快速，但它不適用于富含淀粉、多酚類及多糖類的樣本，因?yàn)榱呀庖篟L加入上述樣本后，會(huì)使樣本變非常粘稠甚至凝固。
“裂解液RS”，采用我司獨(dú)特的“SDS/抗氧化”的方式，可適用于廣泛的植物組織，包含草本植物與本本植物的葉片、具高粘性的多糖多酚類及種子胚乳的植物樣本，此提取方案，增加了額外步驟去除多酚和多糖，RNA的提取總量更高。
本試劑盒提取的總 RNA 純度高，基本沒有基因組、蛋白和其它雜質(zhì)的污染，可用于 PCR、Blot、分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn)。
預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面
1.經(jīng)常更換新手套，因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase污染。
2.使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3.RNA在裂解液RL中時(shí)不會(huì)被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。
4.配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%(V/V)，高壓滅菌）。
使用前注意事項(xiàng)
1.裂解液 RL：使用前請?zhí)砑?300ul 巰基乙醇，添加過巰基乙醇的裂解液 4℃保存。
2.裂解液 RS：使用前請于 50℃水浴將裂解液完全回溶，并添加 450ul 巰基乙醇；添加過巰基乙醇的裂解液RS 繼續(xù)保存于-20℃（建議將添加過巰基乙醇的裂解液 RS 于無酶管分裝成小量，再保存于-20℃）。
3.溶液 BC：使用前請?zhí)砑?30ml 無水乙醇。
4.漂洗液 PW：使用前請向添加 64ml 無水乙醇。
5.為確保 RNA 的品質(zhì)及產(chǎn)量，應(yīng)盡量收取新鮮的動(dòng)物組織進(jìn)行 RNA 提取，或?qū)⒔M織立即以液氮冷凍，儲(chǔ)存于-70℃，組織亦可保存在 RANstore 樣本保存液（目錄號(hào)：TR38）中。
6.鳳梨和蘭花推薦采用“裂解液 RL”。
操作步驟
一、裂解液 RL 操作步驟：
1.勻漿處理
50-100 mg 植物葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入 450ul RL（使用前請先檢查是否已加入 β-巰基乙醇），渦旋劇烈震蕩混勻，并于 56℃孵育 3 分鐘。
注意 1：在 56℃孵育 1-3 min 將有助于植物組織裂解，但是對(duì)于某些富含淀粉的樣品，請不要加熱處理，防止因淀粉引起的樣品膨脹現(xiàn)象。
注意 2：由于植物多樣性非常豐富，而且同種植物的不同生長發(fā)育階段和不同組織的 RNA 含量都不相同，請根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的植物材料的用量。
2.將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱 CS1 上(過濾柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2-5 min，小心吸取收集管中的上清至 RNase-Free 的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。
注意：由于裂解液較粘稠，所以將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱時(shí)，可以剪去部分吸頭末端。
3.緩慢加入 0.5 倍上清體積的無水乙醇，混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），轉(zhuǎn)至“RNA 提取”步驟。
4.將所得“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀），移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g )離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。
注意：將溶液和沉淀轉(zhuǎn)移至吸附柱 CR1 時(shí)，如果體積大于吸附柱容量，可以分次完成。
5.向吸附柱 CR1 中加入 500ul 溶液 RW，12,000 rpm (~13,400×g )離心離心 1 min，丟棄濾液,將吸附柱CR1 放回收集管中。
6.DNase Ⅰ降解。
每一純化反應(yīng)，請將 80 ul DNase 消化液與 10ul DNaseⅠ預(yù)先混合在新的離心管(輕彈或翻轉(zhuǎn)離心管以混合均勻，請勿震蕩)，將 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心，于室溫（25~28℃）孵育15 分鐘。
注意：如同時(shí)操作多組樣本，請使用前現(xiàn)配新鮮的 DNaseⅠ工作液,請勿預(yù)先配制保存 DNaseⅠ工作液。
7.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。
8.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g) 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。
9.重復(fù)操作步驟 8。
10.12,000 rpm(~13,400×g)離心 3 min，將吸附柱 CR1 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余
的乙醇。
注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱 CR1 在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會(huì)影響后續(xù)的 RT 等實(shí)驗(yàn)。
11.將吸附柱 CR1 轉(zhuǎn)入一個(gè)新的 RNase-Free 離心管中，加入 30-100 μl 無酶雙蒸水至吸附柱的膜中心，室溫靜置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，得到 RNA 溶液。
注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 30 μl，體積過小影響回收效率；RNA 溶液請于-70℃保存。
二、裂解液 RS 操作步驟
1.勻漿處理：50-100 mg 植物葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入 450 μl 裂解液 RS（使用前請先檢查是否已加入 β-巰基乙醇），立即渦旋劇烈震蕩混勻，并于 56℃孵育 5-10 分鐘，每隔一段時(shí)間可翻轉(zhuǎn)混合離心管。
注意：由于植物多樣性非常豐富，而且同種植物的不同生長發(fā)育階段和不同組織的 RNA 含量都不相同，請根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的植物材料的用量。
2.加入 150ul 的溶液 GP 至裂解液中，混合均勻，于冰上孵育 5 分鐘，12,000rpm(~13,400×g)離心 5 min。
注意：溶液會(huì)呈現(xiàn)霧狀，為界面活性劑、蛋白質(zhì)、多糖及二次代謝物的沉淀物。
3.移取上清液至過濾柱 CS1 上(過濾柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2 min。
4.小心吸取收集管中的上清至新的 RNase-Free 離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。
5.向溶液中加入 1.5 倍體積的溶液 BC（已添加無水乙醇）,以震蕩或移液器吸吐混合均勻。
注意：加入溶液 BC 后會(huì)形成絲狀沉淀物，不影響 RNA 提取。
6.移取混合液（連同沉淀物一起）至吸附柱 CR1（吸附柱 CR1 放在收集管中），12,000 rpm(~13,400×g) 離心 1 min，丟棄濾液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。
注意：如果混合液體積大于吸附柱容量，可以分次完成。
7.向吸附柱 CR1 中加入 500ul 溶液 RW，12,000rpm(~13,400×g)離心 1min，丟棄濾液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。
8.DNase Ⅰ降解。
每一純化反應(yīng)，請將 80 ul DNase 消化液與 2ul DNaseⅠ預(yù)先混合在新的離心管(輕彈或翻轉(zhuǎn)離心管以混合均勻，請勿震蕩)，將 82 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心，于室溫（25~28℃）孵育15 分鐘。
注意：如同時(shí)操作多組樣本，請使用前現(xiàn)配新鮮的 DNaseⅠ工作液,請勿預(yù)先配制保存 DNaseⅠ工作液。
9.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。
10.向吸附柱 CR1 中加入 600 μl 漂洗液 PW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，丟棄濾液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。
11.重復(fù)操作步驟 10。
12.12,000rpm(~13,400×g)離心 3 min，將吸附柱 CR1 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附柱中殘余的乙醇。
注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱 CR1 在室溫放置片刻，以充分晾干。
如果有漂洗液殘留，可能會(huì)影響后續(xù)的 RT 等實(shí)驗(yàn)。
13.將吸附柱 CR1 轉(zhuǎn)入一個(gè)新的 RNase-Free 離心管中，加入 30-100 μl 無酶雙蒸水至吸附柱的膜中心，室
溫靜置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，得到 RNA 溶液。
注意：洗脫液體積不應(yīng)少于 30μl，體積過小影響回收效率。為了增加產(chǎn)量，可將步驟 13 得到的 RNA 溶液再加入吸附柱 CR1，放置 2min，12,000rpm(~13,400×g)離心 1min，得到 RNA 溶液。RNA 溶液-70℃中保存。
附錄：從高度黏稠性的富含多酚及多糖成分的樣本中提取 RNA
樟科植物樣本，在裂解后粘稠度高、移取困難，可直接于過濾柱中進(jìn)行裂解，以減少移液器吸取的步驟。
1.將過濾柱 CS1 于冰上預(yù)冷，秤取不超過 30mg 的樣本組織，于液氮中迅速研磨，并將研磨的樣本直接轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的過濾柱 CS1 里（過濾柱 CS1 放在收集管中）。
2.加入 600ul 裂解液 RS(已添加巰基乙醇)至過濾柱，于 60℃金屬浴孵育 10 分鐘。
3.12,000 rpm(~13,400×g)離心 5 min，將收集管中的濾液移取至新的 1.5ml 離心管，請避免吸取到沉淀物。
注意：有些樣本可能會(huì)堵塞過濾柱，可再次離心，或?qū)⒐苤惺Ｓ嗟牧呀庖阂浦列碌倪^濾柱 CS1 再次離
心。
4.加入 1/3 倍體積的溶液 GP 至濾液中，混合均勻，于冰上孵育 5 分鐘，12,000 rpm(~13,400×g)離心離心 5 min，將上清液小心轉(zhuǎn)移至新的 1.5ml 離心管，不要觸碰或移取固體沉淀。轉(zhuǎn)至上面“操作步驟5”。
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