選配的試劑

溶菌酶（50mg/ml）目錄號(hào)：GF0203-01，客戶自備，提取細(xì)菌總 RNA 時(shí)需配備

儲(chǔ)存條件

DNase I（為DNase I 凍干粉溶解于專用保存液），儲(chǔ)存于-20℃；

其他試劑室溫（15-25℃）保存。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，提供了快速簡(jiǎn)單且有效的方法，可從培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)菌中提取總RNA。本試劑盒采用離心管柱的方式，配合使用我司獨(dú)特的硫氰酸胍裂解液，使細(xì)胞或細(xì)菌裂解及均質(zhì)化，并加入乙醇使RNA選擇性的與管柱膜結(jié)合，于操作過(guò)程中加入DNase Ⅰ以去除殘留的基因組DNA，經(jīng)過(guò)多次“洗滌及離心”的步驟去除污染雜質(zhì)，再以無(wú)核酸酶水回收結(jié)合在管柱膜上的RNA。若RNA小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,無(wú)法在此系統(tǒng)中被有效地回收。提取的總RNA純度高，基本沒(méi)有DNA和蛋白質(zhì)污染，可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析和分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn)。

預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面

1.經(jīng)常更換新手套，因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase污染。

2.使用無(wú)RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3.RNA在裂解液RL中時(shí)不會(huì)被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4.配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%(V/V)，高壓滅菌）。

使用前注意事項(xiàng)

1.裂解液 RL：使用前請(qǐng)?zhí)砑?300ul 巰基乙醇，添加過(guò)巰基乙醇的裂解液 4℃保存。

2.漂洗液 PW：使用前請(qǐng)?zhí)砑?64ml 無(wú)水乙醇。

3.為確保 RNA 的品質(zhì)及產(chǎn)量，應(yīng)盡量收取新鮮的動(dòng)物組織進(jìn)行 RNA 提取，或?qū)⒔M織立即以液氮冷凍，儲(chǔ)存于-70℃，組織亦可保存在 RANstore 樣本保存液（目錄號(hào)：TR38）中。樣本保存在 RNAstore 試劑中，可于37℃存放 1 天、4℃存放 1 個(gè)月、-20℃永久保存，所提取的 RNA 品質(zhì)與儲(chǔ)存在液氮中相同。

操作步驟

一、從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總 RNA

1.收集細(xì)胞

a.懸浮細(xì)胞的收集（收集細(xì)胞數(shù)量請(qǐng)不要超過(guò) 1×107）：估計(jì)細(xì)胞數(shù)量，300×g 離心 5 min，將細(xì)胞收集到離心管中，仔細(xì)吸除所有培養(yǎng)基上清。

b.單層貼壁細(xì)胞的收集（收集細(xì)胞數(shù)量請(qǐng)不要超過(guò) 1×107）：可直接在培養(yǎng)容器中裂解（容器直徑不超過(guò)10 cm），或者使用胰蛋白酶處理后離心收集細(xì)胞沉淀。（在搖瓶中培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞通常采用胰蛋白酶處理的方法。）

直接裂解法：確定細(xì)胞數(shù)量，徹底吸除細(xì)胞培養(yǎng)基上清，立即進(jìn)行第 2 步裂解步驟。

胰蛋白酶處理法：確定細(xì)胞數(shù)量，吸除培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細(xì)胞，吸除 PBS，向細(xì)胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的 PBS 處理細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離容器壁時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至 RNase-Free 的離心管中，300×g 離心 5 min，收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清。

注意：收集細(xì)胞時(shí)一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會(huì)導(dǎo)致裂解不完全，影響 RNA 與吸附柱的結(jié)合，

造成 RNA 的產(chǎn)量降低;請(qǐng)勿使用過(guò)多的樣本量，避免管柱杜塞而造成 RNA 的產(chǎn)量降低。

2.裂解處理

a.對(duì)于離心得到的細(xì)胞沉淀：輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散，加入適量裂解液 RL（詳見(jiàn)下表，使用

3.將所有溶液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱 CS1 上(過(guò)濾柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2min，收集濾液。

4.向?yàn)V液加入等體積 70%乙醇至裂解液中，混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。

5.將“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀）移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

注意：將溶液和沉淀轉(zhuǎn)移至吸附柱 CR1 時(shí)，如果體積大于吸附柱容量，可以分次完成。

6.向吸附柱 CR1 加入 500ul 溶液 RW，12,000 rpm (~13,400×g )離心離心 1 min，丟棄濾液。

7.DNase Ⅰ降解。

每一純化反應(yīng)，請(qǐng)將 80 ul DNase 消化液與 10ul DNaseⅠ預(yù)先混合在新的離心管(輕彈或翻轉(zhuǎn)離心管以混合均勻，請(qǐng)勿震蕩)，將 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心，于室溫（25~28℃）孵育15 分鐘。

注意：如同時(shí)操作多組樣本，請(qǐng)使用前現(xiàn)配新鮮的 DNaseⅠ工作液,請(qǐng)勿預(yù)先配制保存 DNaseⅠ工作液。

8.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

9.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g) 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

10.重復(fù)操作步驟 9。

11.12,000 rpm(~13,400×g)離心 3 min，將吸附柱 CR1 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱 CR1 在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會(huì)影響后續(xù)的 RT 等實(shí)驗(yàn)。

12.將吸附柱 CR1 轉(zhuǎn)入一個(gè)新的 RNase-Free 離心管中，加入 30-100 μl 無(wú)酶雙蒸水至吸附柱的膜中心，室溫靜置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，得到 RNA 溶液。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 30 μl，體積過(guò)小影響回收效率；RNA 溶液請(qǐng)于-70℃保存。

二、從細(xì)菌中提取總 RNA

1.4℃12,000 rpm(~13,400×g)離心 2 min 收集菌體（收集菌體的最大量不超過(guò) 1×109），仔細(xì)去除所有培養(yǎng)基上清，以后的所有離心步驟均在室溫（20-25℃）進(jìn)行。

注意：如果培養(yǎng)基上清去除不完全，將對(duì)第二步中的細(xì)胞壁消化過(guò)程產(chǎn)生抑制。

2.用含有溶菌酶的 100μl TE 緩沖液（客戶自己配制，配制方法見(jiàn)下表）徹底重懸菌體，孵育時(shí)間見(jiàn)下表。

3.加入 350μl 裂解液 RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巰基乙醇），渦旋振蕩混勻。

4.將裂解混合液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱 CS1 上(過(guò)濾柱 CS1 放入收集管)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2min，收集濾液。

5.向?yàn)V液中加入 250μl 無(wú)水乙醇，混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。

6.將“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀）移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

注意：將溶液和沉淀轉(zhuǎn)移至吸附柱 CR1 時(shí)，如果體積大于吸附柱容量，可以分次完成。

7.向吸附柱 CR1 中加入 500ul 溶液 RW，12,000 rpm (~13,400×g )離心離心 1 min，丟棄濾液，將吸附柱CR1 放回收集管中。

8.DNase Ⅰ降解。

每一純化反應(yīng)，請(qǐng)將 80 ul DNase 消化液與 10ul DNaseⅠ預(yù)先混合在新的離心管(輕彈或翻轉(zhuǎn)離心管以混合均勻，請(qǐng)勿震蕩)，將 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心，于室溫（25~28℃）孵育15 分鐘。

注意：如同時(shí)操作多組樣本，請(qǐng)使用前現(xiàn)配新鮮的 DNaseⅠ工作液,請(qǐng)勿預(yù)先配制保存 DNaseⅠ工作液。

9.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

10.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

11.重復(fù)操作步驟 10。

12.12,000 rpm(~13,400×g)離心 3 min，將吸附柱 CR1 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱 CR1 在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會(huì)影響后續(xù)的 RT 等實(shí)驗(yàn)。

13.將吸附柱 CR1 轉(zhuǎn)入一個(gè)新的 RNase-Free 離心管中，加入 30-100 μl 無(wú)酶雙蒸水至吸附柱的膜中心，室溫靜置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，得到 RNA 溶液。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 30 μl，體積過(guò)小影響回收效率；RNA 溶液請(qǐng)于-70℃保存。