Mouse Colonic Organoid Kit 小鼠結腸類器官培養(yǎng)試劑盒
貨號：K2204-MC
規(guī)格：100ml
500ml
品牌：bioGenous
產品介紹
bioGenousTMMouse Colonic Organoid Kit（小鼠結腸類器官培養(yǎng)試劑盒）是一款用于擴增和分化小鼠結腸類器官的完全培養(yǎng)基。擴增時的小鼠結腸類器官主要由結腸干細胞和結腸祖細胞組成，分化后的小鼠結腸類器官由結腸吸收細胞、杯狀細胞和少量腸內分泌細胞組成。結腸類器官在自我更新和分化能力、組織結構、細胞類型和功能方面，重現了體內結腸上皮的特征，因此是小鼠結腸研究的理想體外模型。
技術參數
產品信息：
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產品組成 |
貨號 |
體積 |
儲存條件及周期 |
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bioGenousTM Mouse Colonic Organoid Basal Medium |
K2204-MC-A100/A500 |
100 mL/500 mL |
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2 mL/10 mL |
-20℃, 避免反復凍融，12個月 |
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bioGenousTM Mouse Colonic Organoid Supplement C(250x) |
K2204-MC-C100/C500 |
0.4 mL/2 mL |
-20℃, 避免反復凍融，12個月 |
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bioGenousTM Mouse Colonic Organoid Supplement D(250x) |
K2204-MC-D100/D500 |
0.4 mL/2 mL |
-20℃, 避免反復凍融，12個月 |
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EDTA (0.5 M, pH 8.0) |
E219121 |
1 mL/2 mL |
15 – 30℃，5年 |
小鼠結腸類器官完全培養(yǎng)基的制備
使用無菌操作技術配制小鼠結腸類器官的擴增或分化培養(yǎng)基。以配制10mL為例配置小鼠結腸類器官擴增或分化培養(yǎng)基，如所需量不同，可相應調整用量。
1. 冰上解凍Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，Mouse Colonic Organoid Supplement C (250x)和Mouse Colonic Organoid Supplement D (250x)。
2. 注意：各Supplement添加物解凍后，建議分別分裝后保存取用，避免反復凍融。
3. 小鼠結腸類器官的擴增培養(yǎng)基：將200uL Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Colonic Organoid Supplement C (250x)和40μL Mouse Colonic Organoid Supplement D (250x)加至9.72mL Mouse Colonic Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠結腸類器官擴增培養(yǎng)基。
4. 小鼠結腸類器官的分化培養(yǎng)基：將200μL Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Colonic Organoid Supplement C (250x)加至9.76mL Mouse Colonic Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠結腸類器官分化培養(yǎng)基。
5. 注意：配制后的小鼠結腸類器官擴增或分化培養(yǎng)基可在2–8°C儲存10天。此外，Mouse Colonic Organoid Supplement B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。
小鼠結腸類器官原代培養(yǎng)
6. 依據所在單位批準的實驗動物倫理及操作規(guī)范進行動物組織取材，取材后的組織須在2 – 8℃組織保存液或DPBS中迅速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離。
7. 準備若干培養(yǎng)皿，加入4℃預冷的DPBS備用。
8. 標準手術操作分離小鼠結腸組織，根據實驗需求取總長度3 – 10 cm的結腸段，置于含DPBS的培養(yǎng)皿中。
9. 于生物安全柜中使用移液管將結腸一端注入DPBS以沖洗腸內容物，沖洗后置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中，反復沖洗數次至內容物完全被沖洗干凈，置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中。
10. 使用手術剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手持手術鑷夾住腸組織一端，另一只手持手術刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復清洗一次。
11. 將清洗后的結腸組織剪碎至約2 mm長寬，并轉移至5–10 mL含有2 mM EDTA的預冷DPBS中消化，4℃孵育30min。
12. 消化完成后，將組織碎片轉移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復一次以去除EDTA。
13. 用5 mL移液管在含冷的DPBS的培養(yǎng)皿或50 mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過移液管尖以產生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結構后，停止吹打并將吹打后的組織懸液通過70μm濾器過濾。
14. 收集濾液，300×g，4℃離心3 min。
15. 棄上清，使用1 mLDPBS重懸組織沉淀，取20 μL懸液進行鏡檢和隱窩計數，計數完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300×g，4℃離心3 min，棄上清后置于冰上預冷。
16. 用適量的Matrigel重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每25 μL Matrigel懸液包含50 – 300個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30 s以避免Matrigel過早凝固。
注意：Matrigel 稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結構穩(wěn)定性。
17. 將Matrigel和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產生并將懸液加入24孔板，25μL每孔滴加在孔底中心，避免懸液接觸孔板側壁。
注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應盡快完成。
18. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。
19. 提前配制小鼠結腸類器官擴增培養(yǎng)基。
20. 每孔沿孔壁加入500 μL提前預熱的小鼠結腸類器官擴增培養(yǎng)基，再向24孔板最外周孔中每孔加入500 μL無菌水，置于37℃溫箱、5% CO2條件下培養(yǎng)。
注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結構。
21. 每 3 d更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應避免破壞Matrigel。
22. 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，原代小鼠結腸類器官應在5 – 7 d內建成。
小鼠結腸類器官傳代培養(yǎng)和分化
1. 用經過Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉移至經過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的1.5mL EP管中。
2. 用經過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與Matrigel分離。
3. 300×g，4℃離心3 min，棄上清，用經過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭加入200 μLOrganoid Dissociation Solution（E238001）并充分混勻，37℃條件下消化1 – 3 min，消化結束后加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium（B213151）吹打混勻。
4. 300×g，4℃離心3 min，棄上清，再次加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 并混勻。
5. 300×g，4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。
6. 用適量的Matrigel重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30 s以避免Matrigel過早凝固。
注意：Matrigel 稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結構穩(wěn)定性。
7. 將Matrigel和類器官的混合懸液點入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側壁，每孔30μL左右。
注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應盡快完成。
8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。
9. 配制小鼠結腸類器官擴增培養(yǎng)基。
10. 待Matrigel完全凝固后，沿孔壁加入提前預熱的小鼠結腸類器官擴增培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL。
11. 將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待新長出的類器官直徑超過100 μm后可進行分化實驗。
12. 分化前需要吸去24孔板培養(yǎng)孔中的小鼠結腸類器官擴增培養(yǎng)基，并加入500μL提前配制的分化培養(yǎng)基，分化通常需要4 d以上時間，分化期間每隔2 d更換一次分化培養(yǎng)基，分化完成后可進行后續(xù)實驗。