Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性相關(guān)實(shí)驗(yàn)的快速、高靈敏度檢測(cè)試劑盒。CCK-8 的主要成分為水溶性四唑鹽[Water Soluble Tetrazolium-8] (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，Water Soluble Tetrazolium-8 是一種類似于 MTT 的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜（Formazan，參考圖 1)。Water Soluble Tetrazolium-8 被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠直接溶解在培養(yǎng)基中。活細(xì)胞的數(shù)目越多，則顏色越深。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

   圖 1. Water Soluble Tetrazolium-8 分子結(jié)構(gòu)及 CCK-8 檢測(cè)原理

本試劑盒提供了一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、使用安全的細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的 MTT 法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)：

（1）MTT法生成的甲臜不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；而 CCK-8 產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，省去了溶解步驟，因此減少了該操作步驟帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差。（2）由于CCK-8產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，無(wú)需吸掉培養(yǎng)基后，再用 DMSO 等有機(jī)溶劑溶解，非常適合用于懸浮細(xì)胞的活性測(cè)定。

（3）與MTT方法相比，CCK-8 法線性范圍更寬，靈敏度更高。

（4）CCK-8法對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，可以多次測(cè)定，選取最佳測(cè)定時(shí)間。

（5）CCK-8法無(wú)需配制，即開(kāi)即用。

（6）CCK-8法適合大規(guī)模、高通量的樣品檢測(cè)。

本試劑盒在在-20℃至少可以保存 3 年，4℃只能保存數(shù)月。建議收到產(chǎn)品后，放-20℃冰箱冷凍保存。第一次使用時(shí)，室溫融化后，建議按自己實(shí)驗(yàn)需要，分裝到滅菌離心管（比如 1 mL/管），繼續(xù)放-20℃冰箱冷凍保存。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，按需從-20℃冰箱取出相應(yīng)數(shù)量的試劑，室溫融化后使用。本產(chǎn)品經(jīng)測(cè)試：5 次左右的反復(fù)凍融，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量幾乎沒(méi)有任何影響。如果 4℃放置的時(shí)間超過(guò)半年，對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響相對(duì)較大。

（1）在 96孔板中配制100 μL 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時(shí)（在 37℃，5% CO2 的條件下）。

（2）向培養(yǎng)板加入10μL 的待測(cè)藥物進(jìn)行處理。

（3）根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段時(shí)間（例如：6, 12，24 或 48 小時(shí)）。

【注】：如果不進(jìn)行藥物處理而直接測(cè)定細(xì)胞的活性，則不需要 2-3 步驟，直接從第 4 步操作。

（4）向每孔加入10μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 OD 值的讀數(shù)）。

（5）將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2-4 小時(shí)。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度。如果暫時(shí)不測(cè)定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 1% SDS（w/v）溶液或者 0.1 M HCl 溶液，并蓋上培養(yǎng)板蓋子，在室溫條件下避光保存。24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

圖2： CCK8  檢驗(yàn)報(bào)告

1）由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，周圍一圈建議不用，改加PBS或水。

2）CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性的原理是通過(guò)檢測(cè)活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)。如果待測(cè)體系中存在還原劑（例如一些抗氧化劑），可能會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，需設(shè)法去除其影響。

3）當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為 1,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)，且加入CCK-8 后孵育的時(shí)間長(zhǎng)一些。

4）如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細(xì)胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8檢測(cè)。

5）酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測(cè)定無(wú)明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除只含有培養(yǎng)基的對(duì)照孔中本底的吸光度而消除，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。