1.???? Phos-tag? Acrylamide的溶解

5mmmol/ Phos-tag? 液體 (3v/v% 甲醇）：

1)??? 10mg? Phos-tag? Acrylamide 里加入 0.1mL 甲醇

2)??? 使用槍頭攪拌混合直至完全溶解。

3)??? ?加3.2mL 蒸餾水， 用槍頭混勻。

2-8℃避光保存。不適合零度以下保存。建議保存時(shí)間6個(gè)月。

　　?注意：避免溶解過(guò)程出現(xiàn)白色懸浮顆粒。

2.???? α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221），陽(yáng)性對(duì)照（含有磷酸化和非磷酸化

　　?α-Casein），如何使用？

　　?用水或者上樣buffer溶解。用水溶解后，冷凍保存。電泳條件：Phos-tag? 50umol/L,分離膠濃度 10%。

　　?電流：30mM，1小時(shí)。

?

3.???? 用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)（018-10693）進(jìn)行磷酸化蛋白的去磷酸化反應(yīng)體系。

37℃，過(guò)夜。# 10 mg/mL phosphorylated protein 50 μL
# 0.50 M Tris/HCl buffer (pH 9.0) containing 0.10 M MgCl2 10 μL
# Sterilized water 39 μL
# Alkaline phosphatase（018-10693）. 0.3 unit / 1 μL有一點(diǎn)需要注意:ALP活性化使用Mg離子，相

　　?同的非磷酸化蛋白質(zhì)用ALP處理的樣品的條帶和沒(méi)有用ALP處理的樣品的條帶的位置不同。

?

4.???? Phos-tag? SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)沒(méi)有成功分離磷酸化蛋白：

1） 使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221）作為陽(yáng)性對(duì)照，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)條

件和試劑均沒(méi)有問(wèn)題。

2） 可使用Phos-tag?Biotin檢測(cè)樣品中是否有磷酸化蛋白。確認(rèn)有磷酸化蛋白后，再通過(guò)

Phos-tag ?SDS-PAGE進(jìn)行分離鑒定。

3） 經(jīng)質(zhì)譜鑒定有表達(dá)磷酸化蛋白，建議增大樣品的含量，可使用Phos-tag ?Agarose進(jìn)行磷酸化蛋白

的富集。磷酸化蛋白含量過(guò)低，會(huì)影響其分離效果。

4） 文獻(xiàn)報(bào)道有表達(dá)磷酸化蛋白，或者同源蛋白有表達(dá)磷酸化蛋白的，建議用Phos-tag? Biotin先確認(rèn)

樣品中是否有磷酸化蛋白。

5） 建議樣品的pH值在7左右。酸性或者堿性條件下，Mn2⁺-Phos-tag?與磷酸化基團(tuán)的特異性結(jié)合較

差。

6） 避免樣品中含有高濃度的還原劑，變性劑，表面活性劑等。β-巰基乙醇濃度不高于0.2M（或者5%）。

7） 進(jìn)行Phos-tag? SDS-PAGE的佳樣品是純化的蛋白。如果是細(xì)胞裂解液，體外激酶反應(yīng)液，組織均

漿液等，需要摸索佳的分離膠，Phos-tag? Acylamide的濃度。建議Phos-tag? Acrylamide濃度

從50uM開始摸索。

?

5.???? Phos-tag?SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化建議：

1） 可以檢測(cè)的樣品包括體外激酶反應(yīng)體系，細(xì)胞裂解液，組織均漿液。

2） 每孔樣品的上樣量是10~30ug（請(qǐng)根據(jù)蛋白表達(dá)量進(jìn)行調(diào)整）

3） 制備樣品中含有的還原劑、變性劑、螯合劑、釩酸等會(huì)使電泳條帶發(fā)生彎曲或者拖尾。通過(guò)TCA沉淀或

滲析法降低雜質(zhì)含量。

4） 建議樣品的pH值在7左右。如果加入上樣緩沖液后溶液顯黃色或者橙色，加入Tris緩沖液調(diào)整pH值為7。

5） 目的蛋白分子量大于60kDa，分離膠的丙烯酰胺濃度為6%；目的蛋白分子量小于60kDa,分離膠的丙烯

酰胺濃度為8%。

6） 如果樣品中含有大量蛋白，比如細(xì)胞裂解液，組織均漿液，Phos-tag? Acylamide濃度為5~25uM。

若目的蛋白濃度低，建議Phos-tag? Acylamide濃度為100uM。

7） Phos-tag ?SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實(shí)驗(yàn)，濕法轉(zhuǎn)膜建議：10mM EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液

處理凝膠10min，不含有EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠10min。重復(fù)3次。強(qiáng)烈建議濕法轉(zhuǎn)膜

8） Phos-tag? SDS PAGE半干法轉(zhuǎn)膜建議：

????????????? i.????? 電泳后用含有EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠，EDTA的濃度為 100mM。100mM EDTA的轉(zhuǎn)移

緩沖液處理凝膠10min，不含有EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠10min。重復(fù)3次。

???????????? ii.????? 轉(zhuǎn)膜的電流值提高2%~3%, 延長(zhǎng)時(shí)間2成。

??????????? iii.????? 轉(zhuǎn)膜的緩沖液加SDS，加到大約0.05~0.2%，轉(zhuǎn)膜效率會(huì)提高。

9） 使用目的蛋白的非磷酸化抗體即可。比如檢測(cè)各種腫瘤細(xì)胞系中Src激酶活性實(shí)驗(yàn)，用Src的非磷酸化抗

體即可。

10） 和光的WIDE-VIEW^TM Prestained Protein Siza MarkerIII(230-02461)可檢測(cè)作為轉(zhuǎn)膜效率，但是無(wú)

法判斷分子量。

11） 一般預(yù)染的蛋白marker在Phos-tag?SDS-PAGE中條帶會(huì)彎曲，無(wú)法判斷蛋白分子量。

12） 不能確認(rèn)磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分離，請(qǐng)進(jìn)行常規(guī)的SDS-PAGE，Western Blotting實(shí)驗(yàn)。比

對(duì)目的蛋白的遷移率。

13） 不能確認(rèn)是因?yàn)榈鞍装l(fā)生磷酸化還是出現(xiàn)降解造成蛋白條帶遷移，請(qǐng)進(jìn)行常規(guī)的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，確

認(rèn)不會(huì)出現(xiàn)條帶遷移。

14） 目的蛋白磷酸化與非磷酸化分離效果不佳，使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated

（038-23221）作為陽(yáng)性對(duì)照，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)條件和試劑均沒(méi)有問(wèn)題。如果確認(rèn)能夠分離，調(diào)整分離膠，

Phos-tag? Acylamide的濃度。建議使用品質(zhì)佳的MnCl2（139-00722）。