WAKO LabAssay ALP 堿性磷酸酶定量檢測(cè)試劑盒

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LabAssay^TM ALP Alkaline Phosphatase Assay Kit 堿性磷酸酶定量檢測(cè)試劑盒
【摘要】
堿性磷酸酶的活性檢測(cè)試劑盒。常用于檢測(cè)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清和骨組織中的堿性磷酸酶活性。
堿性磷酸酶(ALP)廣泛分布于肝臟、骨、小腸之中。特別在骨代謝研究領(lǐng)域方面被用作為骨形成指標(biāo)之一。本品是用p–硝基苯磷酸作為底物的堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒，利用微孔板，可進(jìn)行多種樣品的檢測(cè)。

【檢測(cè)原理】?
樣品在含有p-硝基苯磷酸的碳酸鹽緩沖液(pH9.8)中反應(yīng)，在樣品中的堿性磷酸酶作用下，p-硝基苯磷酸分解為p-硝基酚和磷酸。生成的p-硝基酚為堿性，呈黃色。根據(jù)測(cè)量其405nm的吸光值，計(jì)算出樣品中堿性磷酸酶的活性。

291-58601 LabAssay^TM ALP ?[p-硝基苯磷酸基質(zhì)法]
【性能】
·檢測(cè)范圍：>0.06 mmol/L
·標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0～0.5 mmol/L
·再現(xiàn)性：C.V.<10%

【試劑盒組成】
·底物———————20片（溶解時(shí)：p-硝基苯磷酸二鈉 6.7mmol/L)
·底物溶解液——-100ml×1瓶（2.0mmol/L氯化鎂含有0.1mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.8)
·反應(yīng)終止液——-100ml×1瓶（0.2mol/L氫氧化鈉溶液）
·標(biāo)準(zhǔn)液—————10ml×1瓶（0.5mmol/L p-硝基酚溶液）

【試劑的配制】
1）底物緩沖液：1片底物溶解于5mL底物溶解液中。
2）反應(yīng)終止液：直接使用。
3）系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)液：將標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水依次稀釋為0.5、0.25、0.125、0.0625 mmol/L等2倍率稀釋液系列。

?【標(biāo)準(zhǔn)操作法】
向96孔微孔板內(nèi)添加100μl底物緩沖液和20μl樣品，在微孔板震蕩器上充分振蕩1分鐘后，37℃孵育15分鐘。
添加80μl反應(yīng)終止液，在微孔板震蕩器上充分振蕩1分鐘后，用酶標(biāo)儀測(cè)量405nm處的吸光值。同樣方法進(jìn)行空白(蒸餾水)對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)。

【活性單位的定義】
在pH9.8，37℃情況下，1分鐘內(nèi)生成1nmol p-硝基酚所需的酶的活性為1個(gè)活力單位（U）。
活性（U/μl）= C/15 ×a
C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的OD值(A實(shí)驗(yàn)值減去A空白值)，計(jì)算p-硝基酚濃度(mmol/L=nmol/μl) ?????
15：反應(yīng)時(shí)間(min.)
a：樣品的稀釋倍數(shù)

當(dāng)樣品為成骨細(xì)胞時(shí)，使用本試劑盒前樣本需要預(yù)處理
·在48孔板上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，除去培養(yǎng)基，用PBS沖洗感光板，各孔添加150μl 0.05%的曲拉通X，進(jìn)行凍結(jié)→融化→凍結(jié)→融化操作。4℃，15,000rpm離心15分鐘處理，將上清液移到新的輔助管，以此作為樣品。
(注1）48孔板：培養(yǎng)時(shí)，一般不采用96孔板，多使用48孔板。
(注2) 曲拉通X的作用：溶解細(xì)胞膜，回收蛋白(細(xì)胞內(nèi)含有ALP蛋白)的試劑。
(注3) 反復(fù)的凍結(jié)融化：原理不明，但這樣做似乎可以提高ALP活性。
(注4) 也有不使用曲拉通X，用超聲波降解法(超聲波處理)對(duì)細(xì)胞造成物理性休克得到溶解產(chǎn)物的方法。
(注5) 曲拉通X的添加量：以150μL為例，孔中細(xì)胞約為20,000cell。

WAKO LabAssay系列試劑盒用于人，大鼠以及小鼠血清樣本的檢測(cè)

（?以上試劑盒僅為研究試劑，不可用于診斷或做其他用途）