新型親和法外泌體提取試劑盒

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS采用磷酯酰絲氨酸（PS）親和Tim4蛋白固化磁珠（PS親和法）的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細(xì)胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高純度的外泌體，請使用10,000×g離心后的上清。

該試劑盒使用含有EDTA的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來，所提取的完整外泌體和其他EVs可用于不同實(shí)驗(yàn)，包括電鏡分析（TEM）、納米粒子追蹤（NTA）分析、投喂實(shí)驗(yàn)、分子組成（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等）分析等。

 

◆膜表面磷酯酰絲氨酸（PS）親和法

Tim4蛋白固化磁珠，在金屬離子存在的條件下親和細(xì)胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脫液進(jìn)行洗脫，捕獲高純度的完整細(xì)胞外囊泡

◆優(yōu)點(diǎn)?特色

 

使用新型親和提取方法

●　通過PS親和分子回收 ●　低背景值 ●　在中性條件下通過螯合試劑進(jìn)行溫和洗脫 ※　可獲得高純度，完整的外泌體

無需進(jìn)行超離

●　使用磁珠改進(jìn)了操作

●　流程優(yōu)化

※　高重復(fù)性

與其他提取方法相比
方法	外囊泡純度	囊泡狀態(tài)	可操作性	回收量
PS親和法	■■■	完整	簡便穩(wěn)定	■■■
超速離心法	■■	完整	簡便	■■
聚合物沉淀法	■	完整	簡便快捷	■■■■
密度梯度離心法	■■■■	完整	復(fù)雜	■■
抗體親和法	■■■	不完整	簡便穩(wěn)定	■■

樣品類型：細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿、尿液等。

●　可以純化高純度和完整的細(xì)胞外囊泡

●　可以從細(xì)胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡

●　重復(fù)性高，回收量穩(wěn)定

●　簡易操作（約3.5小時）

●　啟用多個樣品（無需超速離心）

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品名稱	包裝規(guī)格			保存條件
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS	10次 （產(chǎn)品編號：293-77601）	2次 （產(chǎn)品編號：299-77603）	2-10°C
試劑盒成分 (1) 鏈霉親和素磁珠 (2)生物素標(biāo)記的外泌體捕獲 (3)外泌體捕獲免疫固定緩沖液 (4)外泌體結(jié)合增強(qiáng)劑(×500) (5)洗滌緩沖液 (6)外泌體洗脫緩沖液 (7)反應(yīng)管	<10 次> 600 μL×1 管 100 μL×1 管 35 mL×1 瓶 500 μL×1 管 75 mL×2 瓶 5 mL×1 瓶 22 管	<2 次> 120 μL×1 管 20 μL×1 管 7 mL×1 瓶 100 μL×1 管 30 mL×2 瓶 1 mL×1 瓶 1 管

*每套試劑盒能完成5次回收實(shí)驗(yàn)，即實(shí)際使用量為10×5次/Kit與2×5次/Kit

◆案例?應(yīng)用

從血清、血漿、尿液中提取的細(xì)胞外囊泡的分析

從人血清中提取外泌體的產(chǎn)量比較

使用該試劑盒，超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體，接著用CD9和CD63抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

●　檢測抗體

抗CD9兔多抗，System Bioscience公司

抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

各樣品結(jié)果相當(dāng)于150μL的血清樣本。從100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

 

從人EDTA血漿中提取外泌體

分別從1mL的EDTA血漿、EDTA血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中提取外泌體，進(jìn)行WB檢測（抗Flotillin2抗體）。

●　檢測抗體

抗Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司

●　使用樣品量

各1mL

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

各樣品結(jié)果分別對應(yīng)150μL樣品量。從100μL提取物中取出15μL，添加5μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

 

從人尿液中提取外泌體的回收量比較

1mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進(jìn)行外泌體回收，并做免疫印跡（WB）檢測（抗CD9抗體）。

●　檢測抗體

抗CD9兔多抗，System Biosciences公司

●　使用樣品量

各1mL

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

各樣品結(jié)果分別對應(yīng)150μL尿液樣品。從100μL提取物中取出15μL，加入5μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

 

◆與傳統(tǒng)沉淀法的功能比較實(shí)驗(yàn)

　　分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘?xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基）提取外泌體，分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS【PS親和法】

按照試劑盒的操作說明（反應(yīng)時間：3小時），從1mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中提取外泌體。

超速離心法

將10mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）進(jìn)行超離（110,000×g，70min），用TBS緩沖液重懸沉淀物后，再進(jìn)行超離（110,000×g，70min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

從1mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中，按照市售的A公司產(chǎn)品的操作說明（靜置時間：過夜）提取外泌體。

※1：110,000×g離心2小時，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）分析結(jié)果和納米粒子追蹤（NTA）分析結(jié)果

分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體，用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑。另外，用最終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段（2~4×10^10?particles），在透射電子顯微鏡進(jìn)行分析。

電子顯微鏡圖像 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授、大阪大學(xué) iFReC 中井先生

MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子，在透射電子顯微鏡中也可以確認(rèn)到很多細(xì)胞外囊泡。

 

K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的外泌體回收量和純度的比較（無血清培養(yǎng)基）

用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法從K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）獲得樣品進(jìn)行電泳。接著用銀染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

 

回收量，不是回收率

●　檢測抗體

抗CD63小鼠單抗（MEM-259）

抗Flotillin-2 小鼠單抗? （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

抗Lamp-1小鼠單抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司

 

K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取外泌體的回收量和純度的比較（10%FBS-添加培養(yǎng)基）

用MagCapture™外泌體提取試劑盒?、超離法和聚合物沉淀法，從K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（10% 去外泌體 FBS補(bǔ)充培養(yǎng)基）獲得樣品進(jìn)行電泳，用銀染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗體）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時，對外泌體提取片段進(jìn)行質(zhì)譜測定，比較所有測定的多肽中來自K562細(xì)胞的人來源多肽的比例（由于添加到細(xì)胞培養(yǎng)基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的，所以人來源多肽的比率會下降）。

●　檢測抗體

抗CD63小鼠單抗（MEM-259）

抗Flotillin-2小鼠單抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

抗Lamp-1小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司

健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

①運(yùn)用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量

通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

相比超離法，PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產(chǎn)量。

②運(yùn)用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較

運(yùn)用PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

對比AGPC法，使用microRNA提取試劑盒更能有效提取PS親和法純化所得EVs中的microRNA和mRNA

◆外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析

<實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果>

分別利用PS親和法、超離法、聚合物沉淀法，從含10% FBS（不含外泌體）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體。將提取樣品用10%聚丙烯酰胺電泳分離，剪切出全部的蛋白質(zhì)條帶。然后在凝膠內(nèi)進(jìn)行消化，用LC-MS對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組合的相關(guān)性比較。

比較通過MASS分析鑒定的前10個蛋白質(zhì)

白色柱：源自外囊泡的人類蛋白質(zhì)

灰色柱：來自FBS的牛蛋白污染物

紅 色：來自外囊泡的標(biāo)記蛋白

樣品：K562細(xì)胞培養(yǎng)基（含有10%去除外泌體胎牛血清）

	PS親和法	超離法	聚合物沉淀法
1	71kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)	補(bǔ)體C3 (Complement C3)
2	膜聯(lián)蛋白A6 (Annexin A6)	鐵轉(zhuǎn)蛋白受體1 (Transferrin receptor protein1)	α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin)
3	鐵轉(zhuǎn)蛋白受體1 (Transferrin receptor protein1)	血清白蛋白 (Serum albumin)	纖連蛋白 (Fibronectin)
4	V-ATP酶A亞基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A)	ATP依賴RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A)	血清白蛋白 (Serum albumin)
5	浮艦蛋白-2 (Flotillin-2)	微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain)	血小板反應(yīng)蛋白-1 (Thrombospondin-1)
6	程序性細(xì)胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)	71kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	補(bǔ)體C4 (Complement C4)
7	細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain )	脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase)	α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase)
8	膜聯(lián)蛋白A1 (Annexin A1)	細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain)	載脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100)
9	220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa)	U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)	胎兒血紅蛋白亞單位 (Hemoglobin fetal subunit beta)
10	膜聯(lián)蛋白A2 (Annexin A2)	β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain)	β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain)

成對組合相關(guān)性比較

 

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

Protein Assay BCA Kit檢測外泌體的蛋白質(zhì)濃度

Protein Assay BCA Kit是利用二辛可寧酸（BCA）定量檢測溶液中的蛋白質(zhì)濃度的試劑盒，是蛋白質(zhì)定量檢測法中最通用的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質(zhì)Cu2+離子被還原為Cu+。Cu+與BCA形成絡(luò)合物，即產(chǎn)生紫色螯合物，蛋白質(zhì)濃度與紫色螯合物顏色深淺有關(guān)，通過測定562nm處的吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線做比照，即可定量溶液中的蛋白質(zhì)濃度。

利用MagCapture™外泌體提取試劑盒從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體，通過Protein Assay BCA Kit高靈敏的檢測外泌體中蛋白質(zhì)濃度。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果】

將通過MagCapture™外泌體提取試劑盒提取的25μL外泌體溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中試劑A和試劑B混合液200μL。之后60℃孵育30分鐘，檢測560nm吸光度（圖1）。結(jié)果表明，通過Protein Assay BCA Kit的高靈敏度檢測，可測定提取后外泌體中蛋白質(zhì)濃度。

圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度的檢測

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌體蛋白質(zhì)濃度相當(dāng)?shù)停虼薆CA測定時不要稀釋樣品。

①??? 將BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg／mL和空白對照，分別每孔25μL加到96孔板中。

②??? 分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔25μL加入96孔板。

③??? 把200μL Protein Assay BCA Kit（產(chǎn)品編號：297-73101）的試劑A盒試劑B混合液（A:B=50:1）加入放有樣品的孔板中。

④??? 60℃孵育30分鐘

⑤??? 室溫條件下降低孔板溫度

⑥??? 測定560nm的吸光度

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	包裝
297-73101	Protein Assay BCA Kit 蛋白測定試劑盒（二喹啉甲酸）	250次用
015-25613	2 mg/mL Albumin Solution ? from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液	1mL×10

 

◆外泌體的標(biāo)記和Hela細(xì)胞導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)

【實(shí)驗(yàn)概要】

用PKH67（Sigma公司）標(biāo)記MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的細(xì)胞外囊泡， Hela細(xì)胞導(dǎo)入確認(rèn)

<外泌體PKH67標(biāo)記>

1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取外泌體（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液提取外泌體）

2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質(zhì)濃度和粒子濃度

3. 將相當(dāng)于5μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5mL管中。

*請配制合適的使用量

4. 將2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*請配制合適的使用量

5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中，混合后在室溫中孵育5-10分鐘。

6. 根據(jù)附帶的操作說明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）?。═hermo公司）。

7. 將100μL樣品分別加入上述平衡后的旋轉(zhuǎn)柱*中，離心（最大添加量：100μL）。

*準(zhǔn)備必需的支數(shù)。

8. 將外泌體溶液*加入到已經(jīng)接種好Hela細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，24小時后用顯微鏡觀察并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

*根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)外泌體添加量

圖1. PKH標(biāo)記外泌體的細(xì)胞捕獲觀察

從16mL K562培養(yǎng)上清液中超濾濃縮得到4mL培養(yǎng)上清液作為樣品，通過PS親和法提取外泌體。

●????? 提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度：22.3ng/μL

●????? 粒子濃度：1.2×108 particles/mL

將上述標(biāo)記的外泌體溶液全部加入接種好的Hela細(xì)胞中，24小時后用熒光顯微鏡（左）和流式細(xì)胞儀（右）檢測捕獲情況。

Opti-MEM：取相同量用PKH標(biāo)記后添加到細(xì)胞中作為陰性對照。

 

◆細(xì)胞培養(yǎng)上清?血清?血漿的預(yù)處理操作

樣品預(yù)處理：對樣品進(jìn)行1,200×g離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體，則按照下述步驟對樣品進(jìn)行10,000×g離心操作※2。

下文是細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清/血漿的預(yù)處理方法。其他體液樣品的預(yù)處理操作，請參考血清/血漿的實(shí)驗(yàn)步驟，做適當(dāng)調(diào)整。

更換緩沖液（限制過濾）操作

用50 mL TBS 緩沖液對1 mL 已經(jīng)經(jīng)過離心處理的EDTA 血漿樣品進(jìn)行緩沖液更換。

1. 把19 mL TBS 加進(jìn)VivaSpin20（100K）中。

2. 把1 mL 離心過的EDTA 血漿上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，

混勻。

3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下進(jìn)行離心處理。

4. 減少上線的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。

5. 4℃下離心處理。

6. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。

7. 4℃下離心處理。

8. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 緩沖液。

9. 4℃下離心處理直至樣品液量達(dá)到1 mL 以下。

10. 進(jìn)行提取。

 

◆MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 操作步驟

 

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