DNA凝膠回收試劑盒100T品牌：JinPan | 貨號：EK-1101-100T
從各種濃度的瓊脂糖凝膠中回收70bp-100Kbp DNA片段
產(chǎn)品組成
產(chǎn)品介紹
本試劑盒采用可高效、專一結合 DNA 的硅基質(zhì)材料和獨特的緩沖液系統(tǒng)，可從各種濃度的 TAE 或
TBE 瓊脂糖凝膠上回收 70bp-10kbp 大小的 DNA 片段，同時除去蛋白質(zhì)、其它有機化合物、無機鹽離子
及寡核苷酸引物等雜質(zhì)，回收率可達 80%以上。每個離心吸附柱每次可吸附的 DNA 量為 20μg。使用本
試劑盒回收的 DNA 可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉(zhuǎn)化等實驗。
存儲條件
該試劑盒置于室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存 12 個月，更長時間的保存可置于 2-8℃。2-8℃
保存條件下，Buffer QG 可能產(chǎn)生沉淀，使用前可在 55℃水浴中預熱 10 min 以溶解。
需要額外準備的材料
□ 無水乙醇（96%-100%）
□ 無菌 1.5ml 離心管
開始前注意事項 請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
□ 電泳時最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。
□ 如下一步實驗要求較高，核酸電泳時則應盡量使用 TAE 電泳緩沖液。
□ 切膠時，紫外照射時間應盡量短，以免對 DNA 造成損傷。
□ 如果回收率較低，可在膠充分溶解后檢測 pH 值，如 pH 值大于 7.5，可向含有 DNA 的膠溶液中加
10-30μl 3M 醋酸鈉（pH5.2）將 pH 值調(diào)到 5-7 之間。
□ 回收<70bp 或>10kb 的 DNA 片段時，應加大 Buffer QG 的體積，延長吸附和洗脫時間。
□ 回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關，初始量越少、洗脫體積越少，回收率越低。
□ 高溫及潮濕等不利環(huán)境因素對吸附柱產(chǎn)生影響，請將吸附柱儲存于陰涼干燥的環(huán)境中。
開始前試劑準備
□ 按瓶子標簽所示，加入 4 倍體積的無水乙醇稀釋 Buffer PW，于室溫密封保存。
□ 確認 Buffer QG 溶液顯示為黃色。
DNA 濃度及純度檢測
? 回收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。
? DNA 應在 OD260 處有顯著吸收峰，OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA、40μg/ml 單鏈DNA。
? OD260/OD280 比值應為 1.7-2.0，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用 ddH2O 比值會偏低，因為pH 值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。
操作步驟：
1. 配制所需濃度的瓊脂糖凝膠，電泳分離 DNA 片段。當 DNA 片段分離后，將凝膠置于紫外燈下，用干凈鋒利的手術刀快速切下含目的片段大小的 DNA 凝膠。為避免 DNA 片段受到損傷，應盡量減少凝膠的紫外照射時間，切膠時應盡量切去多余凝膠。
2. 放入 1.5ml 離心管中并稱取凝膠塊的重量，加入 3 倍體積的 Buffer QG（如凝膠稱重結果為 100mg，則其體積約等于100μl，應加入 300μl Buffer QG）。對于>2%的瓊脂糖凝膠，添加 6 倍體積的 Buffer QG。
3. 50℃水浴 10min（或直至凝膠完全溶解即可），水浴期間可顛倒混勻加速溶膠。
注意：若回收<300bp 的 DNA 片段可在完全溶膠后加入一倍凝膠體積的異丙醇以提高回收率；膠塊
完全溶解后最好將溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在室溫時結合 DNA 能力較強。
4. 凝膠完全溶解后，檢查顏色是否為黃色（類似于沒有溶解瓊脂糖的 Buffer QG）。如果混合物的顏色為橙色或紫色，則加入 10μl 3 M 醋酸鈉(pH 5.0)并混合，混合物的顏色會變成黃色。DNA 吸附到膜上僅在 pH ≤ 7.5 時有效。Buffer QG 含有一種 pH 指示劑，在 pH ≤7.5 時為黃色，在較高 pH 時為橙色或紫色，可通過顏色輕松確定 DNA 結合的最佳 pH。
5.（選做）向上述溶膠液中加入 1 倍凝膠體積的異丙醇并混合。例如，如果瓊脂糖凝膠切片為 100mg，則添加 100μl 異丙醇。此步驟增加了≤500bp 和≥4 kb 的 DNA片段的產(chǎn)量。對于 500bp-4kb 之間的 DNA 片段，添加異丙醇對產(chǎn)量沒有影響。
6. 將吸附柱套在 2ml 收集管中，并將上一步得到的溶液加入到吸附柱中，≥8000×g(≥10,000 rpm)離心 30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。吸附柱最大容量為 700μl，若樣品體積大于 700μl，可分批加入；為提高回收率，可短暫離心用于溶膠的 1.5ml 離心管后再將溶液轉(zhuǎn)移如吸附柱。
7. 向吸附柱中加入 500μl Buffer PW（已加入無水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)離心 30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
注意：如果回收的 DNA 是用于鹽敏感的實驗，例如平末端連接實驗或直接測序，建議加入 Buffer PW后靜置 2-5min 后再離心。
8. 重復操作步驟 7 一次
9. 倒掉收集管中的廢液后將吸附柱再次套入收集管中，最大轉(zhuǎn)速 (~13,400×g)離心 2min 以干燥吸附柱膜，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱套入新的1.5ml 離心管中并于室溫開蓋放置 5-10min 徹底晾干。注意：Buffer PW 中的乙醇殘留會影響后續(xù)的酶反應（酶切、PCR 等）實驗。
10. 向吸附柱膜中央位置懸空滴加 30-50μl Buffer EB，蓋上蓋子室溫靜置 2min 后，最大轉(zhuǎn)速 (~13,400×g)離心 2min 收集 DNA 溶液并置于-20℃保存。
注意：洗脫體積不應小于 30μl，體積過少影響回收效率。洗脫液的 pH 值對于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測序，需使用 ddH2O 做洗脫液，并保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。為了提高 DNA 的回收量，可重復操作步驟 10 一次。
常見問題：
1.回收效率低
? 凝膠未充分溶解:溶膠時，50~55℃水浴 10min，其間顛倒混勻數(shù)次，讓凝膠充分溶解。
? 凝膠用量過多:過量的凝膠會降低回收率，切膠時盡量去除多余的凝膠。
? 溶膠液不足：3 倍體積的 Buffer QG 是為了保證在各種濃度的瓊脂糖凝膠中都能有較好的回收率，盡量不要節(jié)省。
? 洗脫不充分：建議用 Buffer EB 洗脫兩次，以獲得最高的回收率，洗脫液必須加入柱子的膜中央。
? 試劑準備有誤：Buffer PW 沒有加入乙醇稀釋或體積不準確(乙醇濃度需控制在 80%)。
2. 回收后出現(xiàn)雜帶
? DNA 變性：有些 DNA 片段對溫度比較敏感，雜帶有可能是單鏈的 DNA。降低溶膠溫度至 37~50℃。降低溫度，
可延長溶膠時間至 20~40min 讓凝膠充分溶解。
3. 鹽污染
? A260/230 太低：Buffer QG 溶液中的異硫氰酸胍在 A230 中有較高的吸收峰。使用該產(chǎn)品，A260/230 通常小于 1.0。
實驗表明，該產(chǎn)品得到的 DNA 不會影響下游的運用，包括測序，連接，定量 PCR，PCR，酶切等。
4. 連接不理想
? 乙醇污染：洗脫 DNA 前，打開柱子的蓋子，空氣干燥 10~15min 以徹底去除乙醇。
? 核酸變性：降低溶膠溫度至 37~50℃。降低溫度，可延長溶膠時間至 20~40min 讓凝膠充分溶解。降低溫度能有
效減少核酸的脫嘌呤和變性的影響。
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