產(chǎn)品組成

產(chǎn)品介紹

本試劑盒采用可高效、專一結(jié)合 DNA 的硅基質(zhì)材料和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，可從各種濃度的 TAE 或

TBE 瓊脂糖凝膠上回收 70bp-10kbp 大小的 DNA 片段，同時(shí)除去蛋白質(zhì)、其它有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)鹽離子

及寡核苷酸引物等雜質(zhì)，回收率可達(dá) 80%以上。每個(gè)離心吸附柱每次可吸附的 DNA 量為 20μg。使用本

試劑盒回收的 DNA 可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、文庫(kù)篩選、連接和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。

存儲(chǔ)條件

該試劑盒置于室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存 12 個(gè)月，更長(zhǎng)時(shí)間的保存可置于 2-8℃。2-8℃

保存條件下，Buffer QG 可能產(chǎn)生沉淀，使用前可在 55℃水浴中預(yù)熱 10 min 以溶解。

需要額外準(zhǔn)備的材料

□ 無(wú)水乙醇（96%-100%）

□ 無(wú)菌 1.5ml 離心管

開(kāi)始前注意事項(xiàng) 請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)。

□ 電泳時(shí)最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。

□ 如下一步實(shí)驗(yàn)要求較高，核酸電泳時(shí)則應(yīng)盡量使用 TAE 電泳緩沖液。

□ 切膠時(shí)，紫外照射時(shí)間應(yīng)盡量短，以免對(duì) DNA 造成損傷。

□ 如果回收率較低，可在膠充分溶解后檢測(cè) pH 值，如 pH 值大于 7.5，可向含有 DNA 的膠溶液中加

10-30μl 3M 醋酸鈉（pH5.2）將 pH 值調(diào)到 5-7 之間。

□ 回收<70bp 或>10kb 的 DNA 片段時(shí)，應(yīng)加大 Buffer QG 的體積，延長(zhǎng)吸附和洗脫時(shí)間。

□ 回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關(guān)，初始量越少、洗脫體積越少，回收率越低。

□ 高溫及潮濕等不利環(huán)境因素對(duì)吸附柱產(chǎn)生影響，請(qǐng)將吸附柱儲(chǔ)存于陰涼干燥的環(huán)境中。

開(kāi)始前試劑準(zhǔn)備

□ 按瓶子標(biāo)簽所示，加入 4 倍體積的無(wú)水乙醇稀釋 Buffer PW，于室溫密封保存。

□ 確認(rèn) Buffer QG 溶液顯示為黃色。

DNA 濃度及純度檢測(cè)

? 回收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。

? DNA 應(yīng)在 OD260 處有顯著吸收峰，OD260 值為 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA、40μg/ml 單鏈DNA。

? OD260/OD280 比值應(yīng)為 1.7-2.0，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用 ddH2O 比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H 值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。

操作步驟：

1. 配制所需濃度的瓊脂糖凝膠，電泳分離 DNA 片段。當(dāng) DNA 片段分離后，將凝膠置于紫外燈下，用干凈鋒利的手術(shù)刀快速切下含目的片段大小的 DNA 凝膠。為避免 DNA 片段受到損傷，應(yīng)盡量減少凝膠的紫外照射時(shí)間，切膠時(shí)應(yīng)盡量切去多余凝膠。

2. 放入 1.5ml 離心管中并稱取凝膠塊的重量，加入 3 倍體積的 Buffer QG（如凝膠稱重結(jié)果為 100mg，則其體積約等于100μl，應(yīng)加入 300μl Buffer QG）。對(duì)于>2%的瓊脂糖凝膠，添加 6 倍體積的 Buffer QG。

3. 50℃水浴 10min（或直至凝膠完全溶解即可），水浴期間可顛倒混勻加速溶膠。

注意：若回收<300bp 的 DNA 片段可在完全溶膠后加入一倍凝膠體積的異丙醇以提高回收率；膠塊

完全溶解后最好將溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)槲街谑覝貢r(shí)結(jié)合 DNA 能力較強(qiáng)。

4. 凝膠完全溶解后，檢查顏色是否為黃色（類似于沒(méi)有溶解瓊脂糖的 Buffer QG）。如果混合物的顏色為橙色或紫色，則加入 10μl 3 M 醋酸鈉(pH 5.0)并混合，混合物的顏色會(huì)變成黃色。DNA 吸附到膜上僅在 pH ≤ 7.5 時(shí)有效。Buffer QG 含有一種 pH 指示劑，在 pH ≤7.5 時(shí)為黃色，在較高 pH 時(shí)為橙色或紫色，可通過(guò)顏色輕松確定 DNA 結(jié)合的最佳 pH。

5.（選做）向上述溶膠液中加入 1 倍凝膠體積的異丙醇并混合。例如，如果瓊脂糖凝膠切片為 100mg，則添加 100μl 異丙醇。此步驟增加了≤500bp 和≥4 kb 的 DNA片段的產(chǎn)量。對(duì)于 500bp-4kb 之間的 DNA 片段，添加異丙醇對(duì)產(chǎn)量沒(méi)有影響。

6. 將吸附柱套在 2ml 收集管中，并將上一步得到的溶液加入到吸附柱中，≥8000×g(≥10,000 rpm)離心 30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。吸附柱最大容量為 700μl，若樣品體積大于 700μl，可分批加入；為提高回收率，可短暫離心用于溶膠的 1.5ml 離心管后再將溶液轉(zhuǎn)移如吸附柱。

7. 向吸附柱中加入 500μl Buffer PW（已加入無(wú)水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)離心 30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

注意：如果回收的 DNA 是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，例如平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測(cè)序，建議加入 Buffer PW后靜置 2-5min 后再離心。

8. 重復(fù)操作步驟 7 一次

9. 倒掉收集管中的廢液后將吸附柱再次套入收集管中，最大轉(zhuǎn)速 (~13,400×g)離心 2min 以干燥吸附柱膜，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱套入新的1.5ml 離心管中并于室溫開(kāi)蓋放置 5-10min 徹底晾干。注意：Buffer PW 中的乙醇?xì)埩魰?huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR 等）實(shí)驗(yàn)。

10. 向吸附柱膜中央位置懸空滴加 30-50μl Buffer EB，蓋上蓋子室溫靜置 2min 后，最大轉(zhuǎn)速 (~13,400×g)離心 2min 收集 DNA 溶液并置于-20℃保存。

注意：洗脫體積不應(yīng)小于 30μl，體積過(guò)少影響回收效率。洗脫液的 pH 值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測(cè)序，需使用 ddH2O 做洗脫液，并保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于 7.0 會(huì)降低洗脫效率。為了提高 DNA 的回收量，可重復(fù)操作步驟 10 一次。

常見(jiàn)問(wèn)題：

1.回收效率低

? 凝膠未充分溶解:溶膠時(shí)，50~55℃水浴 10min，其間顛倒混勻數(shù)次，讓凝膠充分溶解。

? 凝膠用量過(guò)多:過(guò)量的凝膠會(huì)降低回收率，切膠時(shí)盡量去除多余的凝膠。

? 溶膠液不足：3 倍體積的 Buffer QG 是為了保證在各種濃度的瓊脂糖凝膠中都能有較好的回收率，盡量不要節(jié)省。

? 洗脫不充分：建議用 Buffer EB 洗脫兩次，以獲得最高的回收率，洗脫液必須加入柱子的膜中央。

? 試劑準(zhǔn)備有誤：Buffer PW 沒(méi)有加入乙醇稀釋或體積不準(zhǔn)確(乙醇濃度需控制在 80%)。

2. 回收后出現(xiàn)雜帶

? DNA 變性：有些 DNA 片段對(duì)溫度比較敏感，雜帶有可能是單鏈的 DNA。降低溶膠溫度至 37~50℃。降低溫度，

可延長(zhǎng)溶膠時(shí)間至 20~40min 讓凝膠充分溶解。

3. 鹽污染

? A260/230 太低：Buffer QG 溶液中的異硫氰酸胍在 A230 中有較高的吸收峰。使用該產(chǎn)品，A260/230 通常小于 1.0。

實(shí)驗(yàn)表明，該產(chǎn)品得到的 DNA 不會(huì)影響下游的運(yùn)用，包括測(cè)序，連接，定量 PCR，PCR，酶切等。

4. 連接不理想

? 乙醇污染：洗脫 DNA 前，打開(kāi)柱子的蓋子，空氣干燥 10~15min 以徹底去除乙醇。

? 核酸變性：降低溶膠溫度至 37~50℃。降低溫度，可延長(zhǎng)溶膠時(shí)間至 20~40min 讓凝膠充分溶解。降低溫度能有

效減少核酸的脫嘌呤和變性的影響。