葉酸干酪培養(yǎng)基

貨號(hào)	品名	規(guī)格	儲(chǔ)存條件	保質(zhì)期
M543	Folic Acid Casei Medium	100G	干粉在8°C下密閉保存，制備好的培養(yǎng)基在2-8°C保存。	干粉見(jiàn)標(biāo)簽有效期。制備好的培養(yǎng)基建議在一周內(nèi)使用。

原理

正常人的血清葉酸水平正常為9.9ng / ml。在身體異?；虻貌r(shí)，葉酸水平會(huì)顯著變化。葉酸干酪培養(yǎng)基采用干酪乳桿菌（ATCC 7469）為測(cè)定用菌，用于葉酸的微生物法測(cè)定。該培養(yǎng)基是基于Flynn等人(1)的配方，并經(jīng)Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于維生素測(cè)定的測(cè)定菌通常需要三種培養(yǎng)基：維持培養(yǎng)基、接種培養(yǎng)基和測(cè)定用培養(yǎng)基。后者通常是化學(xué)限定的培養(yǎng)基，包含所有測(cè)定菌生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，但不含有待測(cè)的分子。類似的，葉酸干酪培養(yǎng)基包含干酪乳桿菌生長(zhǎng)所需的所有成分，但不包含葉酸。因而，添加一系列濃度增加的葉酸，會(huì)觀察到干酪乳桿菌生長(zhǎng)反應(yīng)的遞增。

干酪乳桿菌（ATCC 7469）的貯備菌制備是在AOAC推薦的乳桿菌瓊脂（貨號(hào)M366）試管穿刺接種培養(yǎng)，35-37°C孵育18-24小時(shí)后，試管儲(chǔ)存在冰箱里。每月轉(zhuǎn)接一次。測(cè)定菌液的制備是將貯備菌轉(zhuǎn)種到含10ml微量維生素檢測(cè)接種肉湯（貨號(hào)M133）或乳酸桿菌肉湯（貨號(hào)M367）的試管中。35-37°C孵育24小時(shí)后，在無(wú)菌條件下菌液離心，棄掉上清，再重懸于10ml的無(wú)菌葉酸干酪培養(yǎng)基中（貨號(hào)M543）。再像之前一樣沉淀，并清洗一次。最后，清洗后的菌株重懸于10ml葉酸干酪培養(yǎng)基中，并用該培養(yǎng)基進(jìn)行1:100稀釋。1滴重懸液用于接種到每個(gè)測(cè)定管中。也可用0.85% NaCl代替培養(yǎng)基來(lái)清洗和稀釋。

由于滅菌條件，孵育溫度等因素會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)，并且每次不會(huì)完全一樣，因此每次都應(yīng)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。10ml管內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品量為0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將20mg葉酸干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸餾水中。用0.1N NaOH調(diào)整溶液pH值為10.0，再用0.05N HCl調(diào)pH為 7.0。該溶液含有200g葉酸/ml。用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，則濃度為200ng/ml。再用999ml葉酸緩沖液A（貨號(hào)M544）稀釋1ml該溶液，則為0.2ng/ml的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。每管取0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml該溶液，配置即告完成。

血清樣本的保存：讓血液樣本凝固以分離血清。分離血清至干凈干燥的血清管，并離心除去存在的任何血細(xì)胞。小心操作，避免出現(xiàn)紅細(xì)胞的溶血。分裝血清樣本至于干凈干燥的試管中，每管5ml。每管加入25mg的抗壞血酸。-20°C以下溫度保存。

血清樣本的制備：解凍含有抗壞血酸的血清。向5ml樣品中加入45ml葉酸緩沖液A（M544）。孵育37℃90分鐘。然后15磅121℃高壓滅菌2.5分鐘。離心去除凝固的蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移至清潔干燥的管中。該透明溶液即可用作葉酸待測(cè)的樣本。

樣本葉酸濃度的測(cè)定步驟：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的制備好的血清提取物。加入5ml葉酸干酪培養(yǎng)基和足量的蒸餾水，使每個(gè)試管的總體積為10ml。15磅121°C滅菌5分鐘。冷卻試管并向每個(gè)試管中加入一滴接種液。35-37℃孵育18-24小時(shí)后進(jìn)行濁度讀數(shù)。讀數(shù)前將試管冷藏15-30分鐘以停止細(xì)菌生長(zhǎng)。620nm檢測(cè)吸光度。待測(cè)樣品中的葉酸含量應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定，不過(guò)要考慮樣品稀釋度。

應(yīng)非常小心，避免培養(yǎng)基和玻璃器具被污染。應(yīng)使用潔凈的無(wú)去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

應(yīng)用

葉酸干酪培養(yǎng)基用于葉酸的微生物法測(cè)定。干酪乳桿菌（ATCC 7469）為測(cè)定用菌。

培養(yǎng)基組分

成分?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??克/升

無(wú)維生素酸水解酪蛋白 ? ? ? ? ? ? ? ? 10.000

葡萄糖 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 40.000

醋酸鈉 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 40.000

磷酸氫二鉀 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.000

磷酸二氫鉀 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.000

DL-色氨酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.200

天門冬酰胺 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.600

抗壞血酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4.000

L-胱氨酸鹽酸鹽 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.500

硫酸腺嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.010

尿嘧啶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.010

黃嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

脫水山梨糖醇單油酸酯絡(luò)合物 ? ? ? ? ? 0.100

還原型谷胱甘肽 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.005

硫酸鎂 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.400

氯化鈉 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

硫酸亞鐵 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020

硫酸錳 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.015

核黃素（維生素B2） ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.001

對(duì)氨基苯甲酸（PABA） ? ? ? ? ? ? ? ?0.002

鹽酸吡哆醇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.004

鹽酸硫胺素 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.0004

泛酸鈣 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.0008

煙酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.0008

生物素 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.00002

最終pH值 (25°C) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6.7±0.2

質(zhì)量控制

?外觀——米黃色至黃色均一自由流動(dòng)粉末

?制備好的培養(yǎng)基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀

?配比濃度——在25°C下9.4%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.7±0.1

?pH值——6.60-6.80

配置

稱取9.4g干粉培養(yǎng)基溶于100ml蒸餾水，加入50mg抗壞血酸。加熱至沸騰使培養(yǎng)基完全溶解。測(cè)定時(shí)，分裝至每管為5ml培養(yǎng)基（包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）。加蒸餾水，使總體積達(dá)到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻。

培養(yǎng)反應(yīng)

采用干酪乳桿菌（ATCC 7469）進(jìn)行葉酸的微生物法測(cè)定。35-37°C孵育16-18小時(shí)。

生長(zhǎng)狀況

可獲得良好的生長(zhǎng)。隨著測(cè)定管葉酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度升高（即 0, 0.1,0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1ng），干酪乳桿菌生長(zhǎng)逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。

文獻(xiàn)

1. Flynn, Williams, ODell and Hogan, 1951, Anal. Chem., 23, 180.

2. Baker, Herbert, Frank, Pasher, Hunter, Wasserman and Sobotka, 1959,Clin. Chem., 5, 275.

3. Waters and Mollin, 1961, J. Clin. Path., 14, 335.

根據(jù)我國(guó)的食品安全標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)嬰兒配方食品需測(cè)定葉酸含量，以保證在正常范圍。具體測(cè)定以微生物培養(yǎng)法為首選。小編現(xiàn)將具體過(guò)程拆解如下，以資感興趣人士參考。

所需儀器有天平、培養(yǎng)箱、離心機(jī)（需能放置試管）、超聲波振蕩器、pH計(jì)、分光光度計(jì)、渦旋振蕩器等。所需培養(yǎng)基有維持培養(yǎng)基、接種培養(yǎng)基和測(cè)定培養(yǎng)基，可購(gòu)買商品化產(chǎn)品（建議進(jìn)口產(chǎn)品，以保證質(zhì)量），以節(jié)省人力和時(shí)間。培養(yǎng)基干粉需按產(chǎn)品說(shuō)明制備和滅菌，放置在10℃以下密閉容器中保存。

樣本制備，可直接稱量0.1至0.5g，精確至小數(shù)點(diǎn)后三位，轉(zhuǎn)入100ml錐形瓶中。用80ml氫氧化鈉乙醇溶液溶解，超聲震蕩2-4小時(shí)，加水定容。對(duì)樣本液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使樣本葉酸含量在0.2ng/ml~0.6ng/ml中。

再取3支試管（所用試管需嚴(yán)格鹽酸浸泡和高溫烘干消毒），分別加入0.5、1.0、2.0ml稀釋后的樣本，補(bǔ)水至5ml。再加入5ml葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液，混勻。

制備葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。先制備儲(chǔ)存液（20μg/ml），即稱取20mg標(biāo)準(zhǔn)品，用氫氧化鈉溶液在1000ml容量瓶中溶解定容，再用分光光度法進(jìn)行濃度標(biāo)定。儲(chǔ)存液可在棕色瓶中4℃儲(chǔ)存2年。用儲(chǔ)存液可配置中間液（0.2μg/ml）和工作液（0.2ng/ml）。再配濃度梯度工作液，使葉酸量從0ng, 0.05ng, 0.1ng,0.2ng遞增至1ng（先補(bǔ)水5ml，再加5ml葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液）。再高壓滅菌15分鐘。

測(cè)定時(shí)，向每支測(cè)定管加入20μl接種液，塞好棉塞，37℃培養(yǎng)20-40小時(shí)，直至獲得最大渾濁度。