Himedia維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基 Vitamin B12 Assay Medium
貨號(hào)：M036-100G
品牌：HIMEDIA
產(chǎn)品系列：干粉培養(yǎng)基
包裝：100克
保存條件：
有效期：
產(chǎn)地：印度
維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基
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貨號(hào) |
品名 |
規(guī)格 |
儲(chǔ)存條件 |
保質(zhì)期 |
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M036 |
Vitamin B12 Assay Medium |
100G |
8°C下密閉保存，理想是放置于干燥器中。 |
使用新鮮配置的培養(yǎng)基。干粉見(jiàn)標(biāo)簽有效期。 |
原理
乳酸桿菌生長(zhǎng)需要特別的營(yíng)養(yǎng)，因而在非選擇性培養(yǎng)基上很難生長(zhǎng)。維生素測(cè)定用培養(yǎng)基用于維生素的微生物法測(cè)定。該方法需要三種培養(yǎng)基：即維持培養(yǎng)基，用于保持菌種活力；接種培養(yǎng)基，用于測(cè)試菌液的制備；測(cè)定用培養(yǎng)基，用于待測(cè)維生素的定量。
維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基，不含維生素B12，但包含所有其他維生素和必要養(yǎng)分，用于萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）的生長(zhǎng)。萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測(cè)定用菌，最早由Capp等人描述（1）并被美國(guó)藥典和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）所推薦（2，3）。
用已知稀釋度的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（2，3）。
測(cè)試菌液的制備是將將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，推薦在37°C 孵育24 小時(shí)，再離心、清洗、重懸于10 ml 生理鹽水中，再通過(guò)濁度分析或酸度分析，確定生長(zhǎng)反應(yīng)。
??用維生素B12的濃度及對(duì)應(yīng)的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定待測(cè)樣本中的維生素B12的濃度。
應(yīng)非常小心地避免培養(yǎng)基和玻璃器具的污染。應(yīng)使用潔凈的無(wú)去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
用于接種的測(cè)定菌應(yīng)在專用的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
應(yīng)用
維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基推薦采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測(cè)定用菌，進(jìn)行維生素B12的微生物法測(cè)定。
培養(yǎng)基組分
成分?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??克/升
無(wú)維生素酸水解酪蛋白 ? ? ? ? ? ? ? ? 15.000
葡萄糖 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 40.000
天門冬酰胺 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.200
醋酸鈉 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 20.000
抗壞血酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4.000
L-胱氨酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.400
DL-色氨酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.400
硫酸腺嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020
尿嘧啶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020
黃嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020
核黃素（維生素B2） ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.001
鹽酸硫胺素 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.001
生物素 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.00001
煙酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.002
對(duì)氨基苯甲酸（PABA） ? ? ? ? ? ? ? ?0.002
泛酸鈣 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.001
鹽酸吡哆醇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.004
鹽酸吡哆醛 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.004
鹽酸吡哆胺 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.0008
葉酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.0002
磷酸二氫鉀 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.000
磷酸氫二鉀 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.000
硫酸鎂 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.400
氯化鈉 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020
硫酸亞鐵 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020
硫酸錳 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020
聚山梨酯80 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2.000
鹽酸鳥(niǎo)嘌呤 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.020
最終pH值 (25°C) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6.1±0.2
質(zhì)量控制
?外觀——奶油色至黃色，具均勻性，傾向形成可容易分解成粉末狀的軟塊
?制備好的培養(yǎng)基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀
?配比濃度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.1±0.2
?pH值——5.90-6.30
配置
稱取8.45g干粉培養(yǎng)基溶于100ml蒸餾水，必要時(shí)加熱使培養(yǎng)基完全溶解?；靹颍馆p微的沉淀均勻分布。測(cè)定時(shí)，分裝試管，每管為5ml培養(yǎng)基（包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）。加蒸餾水，使總體積達(dá)到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻培養(yǎng)基。每個(gè)試管(10 ml)的維生素B12水平為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng時(shí)，均可獲得滿意結(jié)果。
培養(yǎng)反應(yīng)
進(jìn)行微生物法測(cè)定維生素B12。采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830），35-37°C孵育18-24小時(shí)。
生長(zhǎng)狀況
隨著測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)品水平升高，（美國(guó)藥典維生素B12標(biāo)準(zhǔn)水平，0，0.025,0.050，0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng)，目標(biāo)菌生長(zhǎng)逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。
文獻(xiàn)
1. ?Capps B. E., Hobbs M. H. H. and Fox S. H., 1949, J. Biol. Chem., 178:517.
2. The United States Pharmacopoeia, 2006, USP29/NF24, The United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.
3.??H. Williams, (Ed.), 2005, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 19th Ed., AOAC,Washington, D.C
微生物法測(cè)定維生素的方法學(xué)評(píng)估
在我國(guó)，微生物法測(cè)定食品中的維生素B12、葉酸、泛酸、煙酸、生物素是首選方法，因此在國(guó)民生計(jì)中起到重要作用。本文擬以維生素B12為例，從方法學(xué)的角度就微生物法的特點(diǎn)，作一文獻(xiàn)上的綜述。
1954年，微生物法測(cè)定乳品中的維生素B12首次出現(xiàn)，是由英國(guó)國(guó)立奶業(yè)研究所、維生素B12的研究專家Margaret E. Gregory首先建立，她用該法測(cè)定來(lái)自不同動(dòng)物種屬的奶中的維生素B12的含量（1）。
微生物法測(cè)定乳品和食品中的維生素B12，在上世紀(jì)90年代引入我國(guó)。關(guān)于這一方法，已有多篇報(bào)道進(jìn)行了方法學(xué)上的探討。現(xiàn)總結(jié)如下：
（一）對(duì)微生物法的評(píng)估
上海市食品藥品檢驗(yàn)所蔣孟虹等人用微生物法測(cè)定了腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)粉劑中的維生素B12 含量。她們認(rèn)為，高效液相色譜法僅適用于常量分析,維生素B12對(duì)色譜前處理要求高, 因此色譜很難滿足痕量測(cè)定的要求。但微生物法操作步驟較多, 一些因素可能影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，她們對(duì)影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
?測(cè)試菌液的透光率在60%～80%之間時(shí), 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合較好，過(guò)高過(guò)低均導(dǎo)致線性擬合差。
?當(dāng)測(cè)試菌液的加入量為50μL時(shí), 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合良好。過(guò)多易導(dǎo)致濁度過(guò)高而不成梯度。
?標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的透光率在30%左右為佳測(cè)定時(shí)間, 此時(shí)各濃度點(diǎn)的透光率差別較大, 可拉開(kāi)梯度。
?維生素B12 在0.001～0.010 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
她們認(rèn)為，微生物法檢出限低、靈敏度高,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 適用于微量維生素B12的含量測(cè)定, 值得經(jīng)常進(jìn)行維生素檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用推廣（2）。
國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心的張玉杰等人提出：微生物法的好處是，測(cè)定的是維生素的生物活性含量，更具生物學(xué)意義。同時(shí)，微生物作為一種活試劑，具有自身的特異性和高度的靈敏性，使得測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。微生物分析法測(cè)定VB12在國(guó)際上已有幾十年的歷史，只是在我國(guó)報(bào)導(dǎo)還不是很多。
他們采用微生物法對(duì)12個(gè)奶基嬰幼兒食品的VB12含量進(jìn)行了多次重復(fù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)相對(duì)誤差均在10%以內(nèi)，50%的樣品測(cè)定的誤差小于5%，回收率多在90-110%之間。因而該方法是可行的，結(jié)果也是準(zhǔn)確可靠的（3）。
廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院林耀文等人發(fā)現(xiàn)，微生物法測(cè)定含乳飲料中的維生素B12，重復(fù)性良好，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，平均回收率為91.20%～102.2%，檢出限為0.04ng/ml，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。（5）
（二）微生物法的干擾因素和注意事項(xiàng)
國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心的張玉杰等人提出了幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：
第一，有些細(xì)菌可以產(chǎn)生Vb12，因此所有玻璃器皿及用具都要嚴(yán)格清洗，嚴(yán)格滅菌。清洗后放入250℃烘箱，加熱1-2小時(shí)。整個(gè)分析過(guò)程都要注意防止溶液過(guò)多地暴露于光線中。
第二，建議每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)三個(gè)平行檢驗(yàn)管，減少誤差。所有檢驗(yàn)管滅菌后要迅速水冷卻，盡量避免顏色形成。冷卻速度要一樣。
第三，測(cè)定菌體濃度時(shí)，要等檢驗(yàn)管內(nèi)發(fā)育和繁殖過(guò)程完全停止后再進(jìn)行。（3）
湖北省宜昌市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所陳緒華等人觀察了測(cè)定培養(yǎng)基的不同品牌對(duì)維生素B12線性的影響。發(fā)現(xiàn)青島海博和北京陸橋的維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基作出的線性結(jié)果不理想，主要是培養(yǎng)基所含的本底較高。而更換為BD的測(cè)定培養(yǎng)基后，所得的線性結(jié)果較理想。本底存在，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)的促生長(zhǎng)作用減弱（即吸光度沒(méi)有等量增加）。當(dāng)測(cè)定培養(yǎng)基中不含本底時(shí)，菌懸液以及培養(yǎng)時(shí)間的微弱變化只影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的生長(zhǎng)量，不影響曲線的線性。（4）
據(jù)我們了解，目前BD的維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基已停產(chǎn)，因此可選用國(guó)際知名的微生物生產(chǎn)商HiMedia的產(chǎn)品。
上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院王志偉等人強(qiáng)調(diào)，菌種的活力和純度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有非常大的影響，應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行菌種純化（7）。
（三）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微生物法的改進(jìn)
廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院吳環(huán)等人提出了幾個(gè)更簡(jiǎn)便的操作技巧用于維生素B12的測(cè)定：一是試驗(yàn)體系的體積縮小。用1.2ｍlPP小管替代了傳統(tǒng)的試管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液及樣品溶液的培養(yǎng)和測(cè)定；標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和樣品溶液的制備也在1.2mlPP小管中進(jìn)行，由此避免了大量玻璃器皿的使用，同時(shí)顯著降低了外部干擾；二是將試驗(yàn)菌株預(yù)先固定在96排管，利用甘油保護(hù)冷凍的菌種。具體操作為：將萊士曼氏乳酸桿菌凍干菌株活化后，接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，（36.0±1.0）℃培養(yǎng)18～24h，將增菌肉湯培養(yǎng)物3000r/min離心數(shù)次，棄去上清液，使用含有甘油的維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基進(jìn)行適宜的稀釋后，將菌懸液加入1.2ｍlPP小管中，-80℃凍存?zhèn)溆?。該方法極大地縮短了試驗(yàn)周期，而且菌株活力穩(wěn)定，保證了試驗(yàn)的有效性。（6）
吳環(huán)等人進(jìn)一步將該方法推廣到嬰幼兒配方乳粉中的其他3種水溶性維生素（葉酸、生物素、肌醇）的測(cè)定，結(jié)果同樣有效。（8）
上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院王志偉等人對(duì)于天然燕麥的維生素B12的測(cè)定，加入了1%的 α-淀粉酶溶液，發(fā)現(xiàn)酶解溶液有助于提取維生素B12，降低樣品粘度，更方便測(cè)量，因此優(yōu)于現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法。
以上探討雖然大部分是針對(duì)維生素B12,但對(duì)于采用微生物法測(cè)定的其他水溶性維生素如葉酸等也同樣有效，可以借鑒。
參考文獻(xiàn)：
1)?Margaret E. Gregory. The Microbiological Assay of ‘Vitamin B12’in the Milk of Different Animal Species.British Journal of Nutrition, 1954,8(04): 340
2）蔣孟虹、許蘋等. 微生物法測(cè)定腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)粉劑中微量維生素B12?的含量.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào). 2016,7(3):893-897
3）張玉杰、呂為群.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測(cè)定微生物分析法.生物技術(shù),1993(6):39-43
4）陳緒華、劉健、江一飛. 不同測(cè)定培養(yǎng)基對(duì)維生素B12線性的影響. 生物技術(shù)世界. 2013(4):47
5）林耀文、佘之蘊(yùn)，李姣等.微生物法測(cè)定含乳飲料中維生素B12含量. 飲料工業(yè).2013,16(4):39-42
6）吳環(huán)、劉冬虹、張慧、聶炎炎、黃宇峰.微生物法快速檢測(cè)食品中維生素B12含量的應(yīng)用研究.中國(guó)乳業(yè).2014,(4):42-44
7)王志偉、徐瓊、陳欣欽、曲勤鳳. 天然燕麥中維生素B12的測(cè)定中2種微生物法前處理方式的比較.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2017,8(1):275-279
8）劉冬虹，吳環(huán)，聶炎炎，黃宇鋒. 優(yōu)化微生物法快速測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中4種水溶性維生素.華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2014(6):594-597
維生素測(cè)定原理及注意事項(xiàng)
維生素是維持機(jī)體不可缺少的一類營(yíng)養(yǎng)，雖然需要量小，但十分重要，一旦缺乏，會(huì)引發(fā)相應(yīng)的維生素缺乏疾病。嬰幼兒食品和乳品中含有天然的維生素，有的也有人工添加。在食品外包裝上，會(huì)要求印有該食品含有哪些營(yíng)養(yǎng)素及其含量多少（1）。我國(guó)的國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)嬰幼兒食品和乳品中的維生素含量也有規(guī)定，如每 100 千卡的食品中的葉酸含量最少為 10.5 μg，最多不超過(guò) 50.2 μg（2）。之所以限定維生素的最高量，是因?yàn)榫S生素?cái)z入過(guò)多，也會(huì)引發(fā)一些問(wèn)題。
那么，如何來(lái)測(cè)定這些維生素的含量呢？根據(jù)國(guó)家出臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)，不少維生素含量是采用色譜的方法來(lái)測(cè)定。有五種維生素是采用微生物法。它們是葉酸、維生素 b12、煙酸、泛酸和生物素。本文重點(diǎn)講述前兩種。以葉酸為例，微生物法的原理是，根據(jù)細(xì)菌對(duì)葉酸的營(yíng)養(yǎng)需求，在一系列不含葉酸的培養(yǎng)基中從低到高添加已知含量的葉酸以及待測(cè)的食品樣品，在 37°C 孵育 18 小時(shí)。因?yàn)橛辛巳~酸，細(xì)菌能生長(zhǎng)得很好，培養(yǎng)液發(fā)生渾濁。細(xì)菌越多，培養(yǎng)基就越渾濁，吸光度就越高。通過(guò)已知含量的葉酸樣品的吸光度，以及待測(cè)樣品的吸光度，就能確定待測(cè)樣品中的葉酸含量。
測(cè)定所用的菌株均有規(guī)定。葉酸為鼠李糖乳桿菌，又稱作干酪乳桿菌鼠李糖亞種（ATCC 7469）（3），維生素 b12 為萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）（4），均可從 ATCC 等菌種庫(kù)購(gòu)買。維生素測(cè)定所用的培養(yǎng)基可以自己配，也可以購(gòu)買商品化的培養(yǎng)基，其來(lái)源好是經(jīng)過(guò)國(guó)際認(rèn)證的微生物培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家，如 HiMedia Laboratories 公司，這樣質(zhì)量較為可靠，其培養(yǎng)基組成也符合食品中葉酸和維生素 B12 測(cè)定的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
在測(cè)定中有兩個(gè)非常重要的注意事項(xiàng)：一是由于滅菌條件，孵育溫度等因素會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)，并且每次該不會(huì)完全一樣，因此每次測(cè)定時(shí)都應(yīng)同時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、應(yīng)小心避免培養(yǎng)基和玻璃器具遭受污染。雜菌生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。同時(shí)應(yīng)使用潔凈的無(wú)去污劑的玻璃器具。因?yàn)槿魏紊倭康耐庠次镔|(zhì)都可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的偏離。
測(cè)定前還需要進(jìn)行菌株的培養(yǎng)和接種菌液的制備。接種菌液來(lái)自于儲(chǔ)備菌種。但保存數(shù)周以上的儲(chǔ)備菌種，不能立即用作接種液制備，實(shí)驗(yàn)前宜連續(xù)傳種 2-3 代以保證細(xì)菌活力。所用培養(yǎng)基也都有商品化的可選。
總之，微生物法測(cè)定微生物 B12 和葉酸等維生素靈敏度高，但也需要注意避免測(cè)定中可能產(chǎn)生的一些問(wèn)題，這樣才能最終把實(shí)驗(yàn)做好。
注釋：
（1）GB 13432—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝特殊膳食用食品標(biāo)簽》
（2）GB10765—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》
（3）GB 5009 211-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》
（4）GB 5413 14-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)_嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12 的測(cè)定》