Wako MagCaptureTM 外泌體提取試劑盒常見問題與技術
MagCaptureTM 外泌體提取試劑盒
Q1 本試劑盒使用了抗體嗎？
Ａ1 沒有使用抗體。使用了與金屬離子結合和與磷脂酰絲氨酸（PS）結合的蛋白。
Q2 用此款試劑盒可提取什么樣的細胞外囊泡呢？
Ａ2 外泌體和大型細胞外囊泡（微小泡）。
Q3 外泌體和微泡的區(qū)別是？
Ａ3 外泌體，是來源于晚期胞內(nèi)體，直徑為40-100nm的細胞外囊泡。微泡來源于細胞膜，直徑100-1000nm的細
胞外囊泡。
Q4 外泌體和微泡能可以分別純化嗎？
Ａ4 可以。同時純化的情況下，1200×g離心取上清液。純化外泌體的情況下，10000×g離心取上清液。只純化微
泡的情況下，10000×g離心，沉淀置于TBS制成懸濁液備用。樣品的前處理請參考操作說明書。
Q5 外殼型病毒也能回收嗎？
A5 能。外殼性病毒膜表面也有PS，混入外殼性病毒的樣品，所有PS都能回收。需要分離的情況下，使用本試劑盒
回收后，需要用與病毒或者外泌體特異性抗原的抗體純化。
Q6 所有的外泌體都會暴露磷脂酰絲氨酸（PS）嗎？
A6 尚未得到實驗驗證。通過分析外泌體的膜脂成分證實，有幾種細胞（小鼠少突膠質細胞）來源于外泌體。因
此，不會暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌體，而此款試劑不能純化這種外泌體。但是，使用
該試劑純化到的外泌體，已確認有多個外泌體標記蛋白，與以單一類型的表面標記蛋白作為抗原的傳統(tǒng)親和方
法相比，以膜脂成分為抗原的該試劑能取得更多種類的外泌體。另外，雖然識別表面標記蛋白的抗體可能無法
識別不同動物來源的抗原，但是該試劑能解決這一問題（人類、小鼠、牛等都能應用）。而且已驗證了可以純
化超速離心時需沉淀才能回收的外泌體。
Q7 該試劑盒的樣品是什么？
A7 使用細胞培養(yǎng)上層清液、血清或尿液效果顯著。如果血漿中添加了螯合劑（比如EDTA）和檸檬酸，原理上無
法分離外泌體。若要回收，可通過超濾更換緩沖液來回收。具體步驟請看相關資料。由于肝素處理過的血漿回
? ? ? ? 收率低，從血液樣本中回收請使用血清。另外有客戶成功從血漿、腦脊髓液中回收外泌體。
Q8 一次能回收多少外泌體？
A8 根據(jù)樣品的種類和數(shù)量有很大的差異，據(jù)研究所實驗記錄，在一次的分離中最多能回收30μg蛋白質（通過
BCA法檢測）、1-2×1010粒子（通過納米技術檢測）。（K562培養(yǎng)基中的莫能菌素能促進外泌體分泌，可取
5mL培養(yǎng)上清液進行回收）。
1 mL正常人混合血清能回收5×109顆粒（通過納米技術檢測）。
? 與傳統(tǒng)法的比較
Q9 與超速離心法相比好處在哪？
A9 與超速離心法相比，本試劑盒能更簡便、重復性好、高效地回收高純度外泌體。也能回收超速離心法無法沉淀
的外泌體。
Q10 與傳統(tǒng)抗體親和法相比，PS親和的優(yōu)勢是什么？
A10 采用傳統(tǒng)的抗體親和法是用變性劑進行洗脫，此款試劑盒是在中性環(huán)境下用螯合劑來洗脫的，能完整回收外
泌體，不會混入非特異性吸附物，能獲得高純度外泌體，提取純度更高。傳統(tǒng)的抗體親和法只能特異性識別
一種外泌體表面Marker蛋白質，而本試劑盒是特異性識別膜脂質成分，更能廣泛獲得外泌體。有事例表明識
別表面Marker蛋白質抗體不能識別不同動物物種的抗原，而本試劑盒能在大范圍的動物物種中運用（人，
小鼠，牛等都有報道）。
Q11 與其他方法相比回收的純度如何？
A11 與傳統(tǒng)沉淀法（超速離心法、多聚物沉淀法）相比，純度更高。與超速離心法和密度梯度離心法相結合的方
法相比，能簡便地獲得同等高純度的外泌體。（原因：采用抗體的傳統(tǒng)親和法是用變性劑進行洗脫，因此很
容易混入粒子等非特異性吸附物。然而此款試劑盒是用螯合劑來洗脫的，所以難以混入非特異性吸附物。）
Q12 與其他方法相比回收率如何？
A12 與采用抗體的傳統(tǒng)親和法、超速離心法相比，能獲得更高的回收率（低于聚合物沉淀法）。
? 關于試劑盒的操作方法、組成
Q13 操作該試劑盒耗時多久？
A13 （1個小時預處理樣品），該試劑盒Exosome Capture 磁珠的固定需要15分鐘，然后3個小時的化學反應，
最后15分鐘洗脫，總計3小時30分鐘。
Q14 本試劑盒需要特別慎重的操作嗎？
A14 Exosome Capture 固定化磁珠與樣品反應后的清洗步驟中最后需要去除洗凈液。完全去除后再進行提取。
提取時在提取液中加入磁珠后，確保磁珠不發(fā)生凝集并處于懸浮狀態(tài)。
Q15 提取液的組成有哪些？
A15 是含有1mM 的螯合劑、鹽、防腐劑的Tris基礎溶液。若以上成分阻礙后續(xù)分析，請使用超速離心膜
（Sartorius公司? VivaSpin500，使用100K分子量截留，Code：VS0141）并替換合適的Buffer。
Q16 Exosome Capture 固定后磁珠可以循環(huán)利用嗎？
A16 可以。為了能夠高效回收樣品中的外泌體，試劑盒可完成5次回收實驗。試劑盒里的緩沖液只含5次純化的
量。1mL體積以上樣本建議進行濃縮后再回收，純化時可進行反復抽提，提高純化效率。詳情參考操作說
明書。
Q17 Exosome Capture 固定化磁珠能保存嗎？
A17 可以。洗脫出外泌體后的磁珠需再使用，用試劑盒附帶的 Washing buffer 或自制的TBS冷藏保存。
Q18 實驗要留到第二天需要做什么步驟？
A18 Exosome Capture 固定化磁珠與樣品的反應步驟（反應時間3小時）可以過夜（置于4℃下）。
? 關于樣品用量
Q19 樣品純化所需的最低量是？
A19 使用旋轉器的需要500μL以上，使用離心管混合器的需要100μL。樣品量更少的情況下加TBS到所需最低量后
再使用Exosome Capture 固定化磁珠。
Q20 大量的樣品能回收嗎？
A20 可濃縮后再回收。如果樣品是培養(yǎng)上清，可以從體積50毫升的樣品中回收外泌體。離心分離預處理后，取
50mL上清液超離濃縮至1mL（推薦Sartorius Viva Spiｎ20 使用100K分子量截留、Code：VS2041）。無
血清培養(yǎng)基和添加了10% FBS的培養(yǎng)基也可以收集外泌體。詳情參照操作說明書。因為血清樣品無法濃縮，
最多只能用１０ｍL的樣品。但是大于1mL的血清回收率低，建議反復提純。
? 關于外泌體提取后的分析
Q21 外泌體中含有什么？
A21 含有蛋白質、脂質、核酸（DNA、microRNA、mRNA）等。
Q22 提取后的細胞外囊泡可以用什么方法檢測？
A22 因為能得到完整的細胞外囊泡，可以使用所有的分析方法。
（例）蛋白質分析：蛋白質電泳、免疫印跡、質譜分析、流式細胞術、ELISA等
核酸分析如：定量PCR、微陣列（生物芯片）、新一代測序等
粒子分析：電鏡分析，納米位點分析（NTA）等
功能分析：體內(nèi)外的用藥實驗等
Q23 提取后的細胞外囊泡（EVs）能直接添加到細胞使用中嗎？
A23 可以使用，但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影響，參考Q15替換合適的Buffer。使用離心過濾
部件。
（Millipore 公司ΜLtrafree – MC， GV 0.22μm 已滅菌、Code：UFC30GV0S）除菌。
Q24 電鏡分析需要外泌體的量是多少？
A24 能用電鏡觀察到2-4×1010的粒子（通過納米技術檢測）。
Q25 提取出的細胞外囊泡的保存條件是？
A25 冷藏、冷凍保存。長期保存需要放到-80℃。
為避免凍結溶解，凍結保存推薦細分后保存。
Q26 如何做回收的外泌體提取液的免疫印跡？
A26 本公司研究所從回收的100 μL提取液抽取15 μL，加入5 μL 4×SDS樣品Buffer，共20μL的樣品全量上樣進行
SDS-PAGE。用量與宣傳冊上的免疫印跡的樣本量一致。
Q27 Exosome質譜檢測的步驟是？
A27 外泌體提取→SDS-PAGE與膠內(nèi)酶切→通過LC-MC/MS進行蛋白質組學分析
? 關于外泌體標記
Q28 用該試劑盒提取出來的囊泡怎么判斷是外泌體呢？
A28 根據(jù)表面抗原的抗體（WB）、電子顯微鏡、密度梯度離心、納米粒度測量（如NanoSight LM10）等來
驗證。
Q29 外泌體分離后用免疫印跡法確認的標記蛋白是什么？
A29 CD9， CD63， CD81， Frotillin-2， Lamp-1等。
? 相關產(chǎn)品
Q30 有在銷售和光檢測外泌體用的抗體嗎？
A30 本公司當前銷售以下抗體。
Anti CD9 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL）
Anti CD81 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL）
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.012-27063）
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.016-27061）
Q31 有可以從分離囊泡里提純RNA的試劑盒嗎？
A31 有。可使用microRNA Extractor SP Kit（295-71701）比AGPC法更能高效提純RNA。
Q32 有銷售磁支架嗎？
A32 有的。Wako品牌，產(chǎn)品編號290-35591，MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架?！?/p>
?
Q33 該技術專利是什么？
A33 已申請PCT專利。
Q34 加入什么金屬離子？
A34 鈣離子
?
Q35 血漿提取方法是？
A35 請查看相關資料。
Q36 試劑盒中的22支反應管有什么特殊之處嗎？用普通的1.5mL離心管可以嗎？
A36 該試劑盒中的反應管使用特殊材質，可減少磁珠吸附，該反應管可單賣
A36 BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。
參考文獻
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