Phos-tag™ 系列磷酸化蛋白新方法
英??文??名：?Phos-tag™?Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution
產 地：?日本
商 家：?Wako（和光純藥工業(yè)株式會社）
wao Phos-tag™實驗設計
◆? 研究領域
磷酸化蛋白和磷酸化多肽的研究
◆? Phos-tagTM?的簡介
Phos-tagTM（Phosphate-binding tag）是由日本廣島大學的Kinoshita等研制的磷酸化蛋白蛋白捕獲分子。Phos-tagTM?螯合Zn2+或者Mn2+等重金屬離子后形成一個半封閉的空間。在pH值6~8的中性條件下，該空間恰好能容納一個磷酸基團，使得螯合有金屬離子的Phos-tagTM?分子能夠與磷酸基團牢固而穩(wěn)定的結合。可以特異性結合所有氨基酸的磷酸化基團，廣泛運用于細菌，酵母，昆蟲等物種研究。
◆? Phos-tagTM?系列產品
利用螯合有金屬離子的Phos-tagTM?可以特異性結合磷酸化基團的特點，研發(fā)了Phos-tagTM?系列產品，運用于常見的蛋白實驗，比如SDS-PAGE，免疫印跡，親和層析，質譜等。
| Phos-tagTM?系列產品 | 產品描述 | 用途 | 具體運用實驗 |
| Phos-tagTM?? Acrylamide | Phos-tagTM?與丙烯酰胺（Acrylamide，SDS-PAGE分離膠主要成分)結合 | 分離磷酸化和非磷酸化蛋白。SDS-PAGE分離膠制備中添加金屬離子（Zn2+或者Mn2+）和Phos-tagTM?Acrylamide。在蛋白電泳過程中，磷酸化基團與金屬離子螯合的Phos-tagTM?Acrylamide發(fā)生特異性結合，導致磷酸化蛋白的遷移速度變慢。 | SDS-PAGE（單一蛋白）
免疫印跡（多種蛋白混合液，例如細胞裂解液，組織均漿液，體外激酶反應體系。使用目的蛋白的非磷酸化抗體作為一抗） |
| Phos-tagTM?Biotin | Phos-tagTM?與生物素（Biotin）結合 | 可與親和素標記的HRP結合，檢測磷酸化蛋白。 | 免疫印跡（正常SDS-PAGE） |
| Phos-tagTM??Agarose | Phos-tagTM?與瓊脂糖（Agarose）結合 | 利用磷酸化基團與金屬離子螯合的Phos-tagTM?Agarose特異性結合，純化磷酸化蛋白。 | 親和層析法 |
| Phos-tagTM?Mass Analytical kit | Phos-tagTM?與不同荷質比的Zn結合 | 檢測微量磷酸化蛋白和磷酸化多肽。 | 質譜實驗 |
備注：除Phos-tagTM?Mass Analytical kit之外，其他Phos-tagTM?系列產品都需要配置金屬離子溶液。
Phos-tag™ 系列磷酸化蛋白新方法！
Phos-tag™ 是一種能與磷酸離子特異性結合的功能性分子。它可用于磷酸化蛋白的分離（Phos-tag™ Acrylamide）、Western Blot檢測（Phos-tag™ Biotin）、蛋白純化 （Phos-tag™ Agarose）及質譜分析MALDI-TOF/MS （Phos-tag™ Mass Analytical Kit）。
◆Phos-tag™ 的基本結構
◆特點
與-2價磷酸根離子的親和性和選擇性高于其它陰離子
在pH 5-8的生理環(huán)境下生成穩(wěn)定的復合物
◆原理
◆應用
樣品類型:?純化蛋白、組織均漿液、組織裂解液、體外酶反應液
樣品來源物種:?無物種特異性，可用于人、植物（擬南芥 水稻 棉花等）、動物（斑馬魚 靈長類等）、微生物(酵母 細菌 真菌等） 昆蟲（果蠅 蠶等）
分離蛋白大小:?磷酸化蛋白的分離范圍在十幾到220kDa，文獻報道可分離350kDa的磷酸化蛋白
準備的試劑和儀器:?10mM的MnCl2溶液，固體產品需要溶解于甲醇中,其余與常規(guī)SDS-PAGE相同
各包裝可做實驗次數(shù):?2mg包裝20μM可制約20塊膠，50μM約8塊；10mg包裝20μM可制100塊膠，50μM約40塊
凝膠染色:?考馬斯亮藍、銀染、熒光染色、陰性染色
◆相關產品
| 產品名稱 | 用 途 |
| Phos-tag™ Acrylamide | 分離: SDS – PAGE 分離不同磷酸化水平的蛋白 |
| SuperSep Phos-tag™ | 分離: 預制膠中含有50μM Phos-tag™ Acrylamide |
| Phos-tag™ Biotin | 檢測: 代替 Western Blot 檢測中的磷酸化抗體 |
| Phos-tag™ Agarose | 純化: 通用柱層析，純化磷酸化蛋白 |
| Phos-tag™ Mass Analytical Kit |
分析: 用于質譜 MALDI-TOF/MS 分析，提高磷酸化分子的檢測靈敏度 |
Phos-tag Acrylamide（丙烯酰胺）
| 產品編號 | 生產商編號 | 產品名稱 | 規(guī)格 | Phos-tag在配制膠中的濃度 | ||
| 20μM | 50μM | 100μM | ||||
| 304-93526 | AAL-107S1 | Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution | 0.3mL | 約10塊 | 約4塊 | 約2塊 |
| 300-93523 | AAL-107M | Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 | 2mg | 約20塊 | 約8塊 | 約4塊 |
| 304-93521 | AAL-107 | Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 | 10mg | 約100塊 | 約40塊 | 約20塊 |
SuperSep?Phos-tag™?（丙烯酰胺預制膠）
| 產品編號 | 產品名稱 | 產品規(guī)格 |
| 193-16711 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?10%,?13?well Phos-tag?13孔10%預制膠 |
5塊 |
| 190-16721 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?10%,?17?well Phos-tag?17孔10%預制膠 |
5塊 |
| 195-16391 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?12.5%,?13?well Phos-tag?13孔12.5%預制膠 |
5塊 |
| 193-16571 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?12.5%,?17?well Phos-tag?17孔12.5%預制膠 |
5塊 |
| 193-16691 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?15%,?13?well Phos-tag?13孔15%預制膠 |
5塊 |
| 196-16701 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?15%,?17?well Phos-tag?17孔15%預制膠 |
5塊 |
| 197-16851 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?17.5%,?13?well Phos-tag?13孔17.5%預制膠 |
5塊 |
| 194-16861 | SuperSep?Phos-tag™?(50?μmol/L),?17.5%,?17?well Phos-tag?17孔17.5%預制膠 |
5塊 |
| 198-17981 | SuperSep™?Phos-tag™?(50μmol/l),?7.5%,?17well,?83×100×3.9mm Phos-tag™?預制膠，BioRad型 |
5塊 |
| 195-17991 | SuperSep™?Phos-tag™?(50μmol/l),?12.5%,?17well,?83×100×3.9mm Phos-tag™?預制膠，BioRad型 |
5塊 |
| 192-18001 | SuperSep™?Phos-tag™?(50μmol/l),?7.5%,?17well,?100×100×6.6mm Phos-tag™?預制膠，Life?Technologies型 |
5塊 |
| 199-18011 | SuperSep™?Phos-tag™?(50μmol/l),?12.5%,?17well,?100×100×6.6mm Phos-tag™?預制膠，Life?Technologies型 |
5塊 |
Phos-tag™ Biotin（生物素）
| 產品編號 | 生產商編號 | 產品名稱 | 規(guī)格 |
| 301-93531 | BTL-104 | Phos-tag™ Biotin BTL-104 | 10mg |
| 308-97201 | BTL-111S1 | Phos-tag Biotin BTL-111 1mM Aqueous Solution | 0.1ml |
Phos-tag™ Agarose（瓊脂糖）
| 產品編號 | 生產商編號 | 產品名稱 | 規(guī)格 |
| 302-93561 | AG-501 | Phos-tag™ Agarose | 0.5ml |
| 308-93563 | AG-503 | Phos-tag™ Agarose | 3ml |
Phos-tag™ Mass Analytical Kit（質譜分析試劑盒）
| 產品編號 | 生產商編號 | 產品名稱 | 規(guī)格 |
| 305-93551 | MS-101KIT | Phos-tag™ Mass Analytical Kit | 1 set |
SuperSep Phos-tag™ 預制膠即開即用！
phos-tag™ 由日本廣島大學研究生院醫(yī)齒藥學綜合研究科醫(yī)藥分子功能科學研究室開發(fā)。
SuperSep Phos-tag™ 是一種預制膠，預先加入了50 μmol/L的Phos-tag™ Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預制膠中含有鋅作為金屬離子，在中性凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好，得到的結果條帶也很整齊。
| ?板大小 | ?100 x 100 x 3 (mm) | |
| ?凝膠大小 | ?90 x 85 x 1 (mm) | |
| ?孔數(shù) | ?13 | ?17 |
| ?孔容積 | ?30 μL | ?25 μL |
| ?Phos-tag™濃度 | ?50 μmol/L | |
| ?丙烯酰胺濃度 | ?10%、12.5%、15% 和17% | |
| ?ZnCl2濃度 | ?100 μmol/L | |
◆優(yōu)點、特色
·即開即用
·預制膠使用安全
·可長期保存（6個月）
·操作與普通SDS-PAGE一樣
◆案例、應用
電泳條件：30 mA（恒電流）, 60分鐘
樣品：5 ug/Lane α-酪蛋白（含磷酸化與去磷酸化α-酪蛋白）（產品編號038-23221）
普通SDS-PAGE只觀察到一條條帶，而Phos-tag™ SDS-PAGE里可見α-酪蛋白磷酸化和α-酪蛋白去磷酸化兩條
條帶。
樣品緩沖液：Sample Buffer Solution (2ME+) (X4) (產品編號191-13272)
電泳緩沖液：SDS-PAGE 緩沖液, pH8.5(產品編號192-16801)
染色：QUICK CBB PLUS(產品編號174-00553)
P10%(左) : SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13well
P15%(中) : SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13well
A15%(右) : SuperSep™Ace, 15%, 13well （不含Phos-tag™）
◆相關產品
| 產品編號 | 產品名稱 | 規(guī) 格 |
| ?058-07681 | ?EasySeparator <配套電泳槽> | ?1 套 |
| ?230-02461 | ?Wide-View Prestained Protein Size Marker III (11~245kDa) | ?500 μL (200 次) |
| ?038-23221 | ?α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated | ?1 mg |
◆具體實例
1. 體外激酶反應，激酶和底物都帶有標簽，反應后親和層析法純化獲得激酶和底物，如何檢測底物的磷酸化情況？
如果底物和激酶分子量差別大，通過正常的SDS-PAGE能夠區(qū)分，建議使用Phos-tagTM Biotin。將激酶和底物進行免疫印跡實驗，用Phos-tagTM Biotin作為抗體檢測底物的磷酸化基團（需記錄底物的條帶位置）。可通過剝離（strip）方式剝離Phos-tagTM Biotin，用底物的非磷酸化抗體進一步驗證其位置。
如果底物和激酶分子量差別不大，可進行Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE實驗,然后轉膜，用底物的非磷酸化抗體檢測（沒有使用激酶的抗體，所以檢測不到激酶的帶）。在Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE中磷酸化和非磷酸化底物發(fā)生分離，用底物的非磷酸化抗體可以檢測所有底物。免疫印跡實驗后，觀察所有的條帶，非磷酸化底物由于沒有和Mn2+-Phos-tagTM Acrylamide結合，所以遷移速度較快，磷酸化底物則遷移速度變慢。通過遷移率的變化，分析磷酸化底物的含量。
備注：
1） Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE實驗中，建議使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-
?????? 23221），該產品中含有磷酸化和非磷酸化的α-Casein，確保試劑和實驗條件能夠分離磷酸化蛋白。
2）如果沒有非磷酸化底物，可使用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)（018-10693）對底物進行去磷酸
???? 化反應。
2. 如何檢測EGF（表皮生長因子）刺激后細胞內MAPK的磷酸化水平？
收集EGF刺激的細胞，制備細胞裂解液作為樣品。進行正常的SDS-PAGE實驗和Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE實驗，轉膜后用MAPK的非磷酸化抗體作為一抗進行檢測（檢測所有的MAPK，包括磷酸化和非磷酸化）。正常SDS-PAGE實驗中，磷酸化的MAPK和非磷酸化MAPK沒有分離，而在Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE實驗中磷酸化MAPK和非磷酸胡MAPK發(fā)生分離，所以轉膜后，用MAPK抗體檢測，可以看到分離的條帶。比較正常的SDS-PAGE用MAPK抗體的免疫印跡實驗和Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE用MAOK抗體的免疫印跡實驗，多出來的條帶就是磷酸化的MAPK。
備注：該實驗的前提是EGF刺激后細胞內的MAPK發(fā)生磷酸化，細胞內包含磷酸化和非磷酸化的MAPK。如果刺激后細
????????? 胞內不含有磷酸化的MAPK，則無法用Phos-tagTM Acrylamide分離磷酸化和非磷酸化MAPK。
3. 研究蛋白相互作用的實驗中，構建帶有不同標簽的2種融合蛋白，共轉染細胞，在細胞內發(fā)生磷酸化反應。通過不同標
??? 簽的親和層析柱獲得純化的蛋白，是否可用Phos-tagTM Agarose純化，進行后續(xù)免疫共沉淀實驗（Co-IP）實驗？
Phos-tagTM Agarose純化磷酸化蛋白，采用高鹽的洗脫方式，沒有使用界面活性劑、還原劑、酸或者堿洗脫，蛋白不發(fā)生變性，可進行后續(xù)的Co-IP實驗。
4. 檢測的樣品中含有兩種磷酸化的蛋白，分子量很接近，如何使用Phos-tagTM 產品檢測磷酸化？
如果樣品中兩種磷酸化蛋白的分子量很接近，通過正常的SDS-PAGE實驗無法區(qū)分，建議使用Phos-tagTMAcrylamide。進行Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE實驗后用兩種蛋白的非磷酸化抗體進行檢測。
也可以使用Phos-tagTM Biotin。進行正常SDS-PAGE實驗后，先用兩種蛋白的非磷酸化抗體進行檢測，剝離（strip）后用Phos-tagTM Biotin。如果磷酸化蛋白量少的 話，剝離（strip）會去除一些蛋白，可能會影響檢測的效果。
5. 使用Phos-tagTM Mass Analytical kit，樣品中如果含有磷酸緩沖液是否有影響？
該試劑盒檢測磷酸化蛋白和多肽的靈敏度較高，樣品中含有的磷酸緩沖液會影響磷酸化蛋白與Phos-tagTM 結合。