磷酸化蛋白電泳試劑——wako Phos-tag (TM) Acrylamide

什么是Phos-tag™

Phos-tag ™ 是一種能與磷酸離子特異性結(jié)合的功能性分子，結(jié)合特異性與氨基酸的種類(lèi)和序列無(wú)關(guān)，無(wú)放射性，無(wú)需特意制備磷酸化抗體。它可用于磷酸化蛋白的分離（Phos-tag™ Acrylamide）、Western Blot 檢測(cè)（Phos-tag ™ Biotin）、蛋白純化 （Phos-tag ™ Agarose）及質(zhì)譜分析MALDI-TOF/MS （Phos-tag ™ Mass Analytical Kit） 。

Phos-tag的基本結(jié)構(gòu)：

 

 

 

 

 

 

1. Phos-tag ™ Acrylamide 介紹

Phos-tag™ Acrylamide SDS-PAGE可根據(jù)遷移率不同，區(qū)分磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白。該方法只需在常規(guī)的SDS-PAGE膠中添加Phos-tag™ Acrylamide和MnCl₂即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（制膠過(guò)程中添加，如需詳細(xì)說(shuō)明請(qǐng)聯(lián)系我們）。

特點(diǎn)
# 非放射性元素，非熒光物質(zhì)
# 磷酸化蛋白亞型可以在同一電泳道分離出多條帶
# 操作簡(jiǎn)便，與常規(guī)SDS-PAGE蛋白電泳相似
# Phos-tag™ 的結(jié)合特異性與氨基酸種類(lèi)、序列無(wú)關(guān)
# Phos-tag™ SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)后，可進(jìn)行常規(guī)的免疫組化、質(zhì)譜等
# 性質(zhì)穩(wěn)定，溶于蒸餾水后可以穩(wěn)定保存至少3個(gè)月
# 磷酸化和非磷酸化蛋白可以同時(shí)被分離檢測(cè)
# 不同位點(diǎn)磷酸化修飾以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因遷移率不同而被分離開(kāi)來(lái)

原理

應(yīng)用

1、黃色粘性油狀物質(zhì)；

2、在4度可保存至少一年；

3、Phos-tagTM與丙烯酰胺（Acrylamide，SDS-PAGE分離膠主要成分)結(jié)合分離磷酸化和非磷酸化蛋白。

SDS-PAGE分離膠制備中添加金屬離子（Zn2+或者M(jìn)n2+）和Phos-tagTM Acrylamide。

在蛋白電泳過(guò)程中，磷酸化基團(tuán)與金屬離子螯合的Phos-tagTM Acrylamide發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致磷酸化蛋白的遷移速度變慢。

Phos-tag? Acrylamide可根據(jù)遷移率不同，區(qū)分磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白。無(wú)放射性、非化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記。不同位點(diǎn)磷酸化修飾的蛋白在同一泳道中因遷移率不同而被分離開(kāi)來(lái)。

操作過(guò)程與普通SDS-PAGE相類(lèi)似。Phos-tagTM的特異性結(jié)合與氨基酸種類(lèi)、序列無(wú)關(guān)。

適用于免疫印跡、質(zhì)譜分析等后續(xù)工作?？勺R(shí)別磷酸化和非磷酸化蛋白。

Phos-tagTM母液可穩(wěn)定保存至少3個(gè)月。

可檢測(cè)出具有不同磷酸基團(tuán)數(shù)目的蛋白。無(wú)需特意制備磷酸化抗體。

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	規(guī)格	原價(jià)
304-93526	Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution	0.3ml	2670
300-93523	Phos-tag™ Acrylamide AAL-107	2mg	4450
304-93521	Phos-tag™ Acrylamide AAL-107	10mg	10680

Phos-tag Acrylamide (AAL-107)? ? ?Wako Cat. #304-93521 (10 mg)]? Protocol(點(diǎn)擊進(jìn)入下載)

Phos-tag Acrylamide (AAL-107)? ?Wako Cat. #300-93523 (2 mg)]? Protocol(點(diǎn)擊進(jìn)入下載)

Phos-tag ™ Acrylamide使用的相關(guān)問(wèn)題解答

【檢測(cè)】
Q. 可檢測(cè)磷酸化蛋白嗎？
A. 可以，用定性染色法（如考馬斯亮藍(lán)）染色，再檢測(cè)條帶的強(qiáng)弱即可。推薦使用產(chǎn)品如 “Quick-CBB
PLUS”。
【相關(guān)產(chǎn)品】 Quick-CBB PLUS（產(chǎn)品編號(hào)178-00551，1 L；產(chǎn)品編號(hào)174-00553，250 mL）
【分離】

Q. 此產(chǎn)品可分離多大的蛋白 (kDa) ？
A. 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，可分離 350 kDa 的磷酸化蛋白（20 μM Phos-tag, 3% 丙烯酰胺 + 0.5% 瓊脂糖）。
【參考文獻(xiàn)】Proteomics , 9, 4098-4101 (2009), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, H. Uchijima, and K. K
* 添加瓊脂糖，可增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度。

Q. 如何提高分辨率？
A. 一般情況下，較高濃度的Phos-tag ™ 可以獲得較高的分辨率。然而，增加Phos-tag ™ 的濃度會(huì)引起整
個(gè)蛋白電泳的速度成比例地變慢。

【染色】
Q. 除考馬斯亮藍(lán)外，凝膠是否可以用銀染、熒光染色和陰性染色?
A. 可以。
【相關(guān)產(chǎn)品】Silver Stain 2 Kit Wako（產(chǎn)品編號(hào)291-50301; 10 sheets）, Silver Stain Kit Wako （產(chǎn)
品編號(hào)299-13841; 10 sheets）； Negative Gel Stain MS Kit（產(chǎn)品編號(hào)293-57701; 20 tests）

Q. CBB 染色后，脫色效果不好？
A. 脫色時(shí)可用微波爐略微加熱。
方法：把染色后的凝膠放入100 mL 去離子水中，放入幾張面巾紙，用微波爐略微加熱數(shù)分鐘，更換去離
子水與面巾紙。重復(fù)操作3-4 次。

【試劑及凝膠的配制】
Q. 除此產(chǎn)品外，還需要哪些試劑和儀器？
A. 需10 mM 的MnCl2 溶液。其余試劑和儀器與常規(guī)SDS-PAGE 相同。

【試劑及凝膠的配制】
Q. 除此產(chǎn)品外，還需要哪些試劑和儀器？
A. 需10 mM 的MnCl2 溶液。其余試劑和儀器與常規(guī)SDS-PAGE 相同。

Q. 實(shí)驗(yàn)中需要的甲醇與MnCl 是哪個(gè)級(jí)別的試劑？
A. 都是市售分析純。

【樣品要求】
Q. 樣品必須是純化的蛋白嗎？是否可以用細(xì)胞裂解液？
A. 不一定是純化的蛋白，細(xì)胞裂解液也可以。如果是純化的樣品，做SDS-PAGE 就可以。如果是蛋白裂解液
則需要做免疫印跡。

【Phos-tag ™ Acrylamide 的使用】
Q. 該產(chǎn)品10mg 包裝可做多少次實(shí)驗(yàn)？
A. 取決于 Phos-tag ™的使用濃度，如：10 mg 包
裝，若凝膠厚1 mm，寬9 cm，長(zhǎng)7.7 cm，則
Phos-tag ™ 20 μM 可制 100 塊膠，50 μM40 塊，
100 μM20 塊。其他包裝及對(duì)應(yīng)次數(shù)見(jiàn)右圖。

【Phos-tag ™ SDS-PAGE 配制膠】
Q. 如何配制Phos-tag ™ SDS-PAGE 膠？
A. 只需在配常規(guī)SDS-PAGE 膠時(shí)加入Phos-tag ™ Acrylamide 和MnCl2。凝膠時(shí)間略長(zhǎng)于常規(guī)SDSPAGE
。配制好的凝膠在幾天內(nèi)會(huì)不穩(wěn)定，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

【Phos-tag ™ SDS-PAGE 操作】
Q. 每孔樣品的上樣量是多少？
A. 純化蛋白：1-5 μg（CBB 染色法），組織細(xì)胞抽提液：10-30 μg（請(qǐng)根據(jù)蛋白表達(dá)量進(jìn)行調(diào)整）。
※ 以上為估計(jì)值，請(qǐng)先用適量的樣品進(jìn)行常規(guī)蛋白免疫印跡、SDS-PAGE 來(lái)摸索。

【凝膠強(qiáng)度】
Q. 凝膠容易破損，請(qǐng)問(wèn)要如何改善？
A. 丙烯酰胺濃度低的凝膠容易破損，因此，提高亞甲基雙丙烯酰胺對(duì)丙烯酰胺的比
例（如24:1）即可改善。
【配制好的含Phos-tag ™ 的凝膠穩(wěn)定性】

Q. 配制好的含Phos-tag ™ Acrylamide 的凝膠可存放多久？
A. 配制好的凝膠在幾天內(nèi)會(huì)不穩(wěn)定，因此建議現(xiàn)用現(xiàn)配。
【Phos-tag ™溶液穩(wěn)定性】

Q. 溶于甲醇和水中的母液可保存多久？
A. 據(jù)報(bào)道，4 ℃避光條件下能保存6 個(gè)月以上。

【試劑制備】
Q. Phos-tag ™ 的濃度與溶液中Mn2+ 的摩爾比例為多少？
A. Phos-tag ™ 丙烯酰胺與Mn2+ 的摩爾比應(yīng)該為1:2，兩個(gè)Mn2+ 離子結(jié)合一個(gè)
Phos-tag ™ 分子（如圖1）。

Q. 按照實(shí)驗(yàn)流程中的方法配制Phos-tag ™，結(jié)果出現(xiàn)混濁，這正常嗎？
A. 正常?；鞚崾怯捎诩状荚斐傻模o置一會(huì)，溶液就會(huì)變得澄清。

Q. 可否僅用水來(lái)溶解Phos-tag ™？
A. 可以?xún)H用水溶，只是比溶解在含甲醇的水中時(shí)間長(zhǎng)些。若不能完全溶解，離心，
取上清使用。

【分子marker】
Q. 可使用哪種預(yù)染marker ？
A. 一般的預(yù)染marker 在Phos-tag ™ 凝膠里條帶會(huì)歪曲（如圖2）。使用和光的WIDE-VIEW ™ Prestained
Protein Size Marker Ⅲ（產(chǎn)品編號(hào)230-02461）效果會(huì)好一些，可作為轉(zhuǎn)膜效率的標(biāo)記，但是無(wú)法推斷
分子量。請(qǐng)單獨(dú)留出一泳道。

【有ATP 存在下的磷酸化反應(yīng)】
Q. 磷酸化反應(yīng)液中存在ATP，是否會(huì)對(duì)電泳造成影響？
A. ATP 濃度在2.0 mM 時(shí)不會(huì)有什么特殊影響。使用限量還不清楚。

【預(yù)制膠】
Q. 能否能將此產(chǎn)品與樣品混合后，在普通預(yù)制膠中進(jìn)行電泳？
A. 不可以。但可選擇使用含有Phos-tag ™的預(yù)制膠SuperSep ™ Phos-tag ™ （參考p18）。

【DNA 的分離】
Q. Phos-tag ™ 適合用于分離DNA 嗎？
A. 參考以下文獻(xiàn)：
?A SNP genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis, Analytical Biochemistry ,
361, 294-298 (2007), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike (The phosphate group at DNA-terminal is
efficiently captured by Zn2+-Phos-tag ™ .)
?A mobility shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate affinity polyacrylamide gel
electrophoresis, Analytical Biochemistry , 378, 102-104 (2008), E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】
Q. 為什么會(huì)出現(xiàn)條帶彎曲、拖尾現(xiàn)象？
A. EDTA、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、表面活性劑都是造成條帶偏移或者拖尾的原因。所以電泳前可先用TCA 沉淀法或者透
析把樣品脫鹽。在樣品量不夠的情況下，可在空的泳道中加入適量上樣緩沖液（×1），隨后再進(jìn)行電泳。

Q. 電泳后，怎么判斷這些條帶是因?yàn)榈鞍椎牧姿峄鸬模?br /> A. 相同樣品使用12.5% SuperSep ™ Ace（產(chǎn)品編號(hào)199-14971）進(jìn)行電泳，確認(rèn)目的蛋白沒(méi)有出現(xiàn)多條帶。

Q. 靶蛋白磷酸化與非磷酸化分離效果不佳，怎么辦？
A. 請(qǐng)先確認(rèn)作為陽(yáng)性對(duì)照的β‐酪蛋白和作為陰性對(duì)照的經(jīng)去磷酸化酶處理過(guò)的β‐酪蛋白的分離情況（產(chǎn)品編
號(hào)：038-23221）。如果確認(rèn)能夠分離的話，可能本產(chǎn)品的Phos-tag ™ 濃度或者丙烯酰胺的濃度不能分
離目的蛋白的磷酸化和非磷酸化。

【后續(xù)實(shí)驗(yàn)】
Q. Phos-tag ™ Acrylamide 實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行質(zhì)譜分析，需要進(jìn)行特殊處理嗎？
A. 無(wú)需進(jìn)行特殊處理，即可進(jìn)行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。

Q. 做免疫印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否可以用NC 膜代替PVDF 膜？A. 可以。但是Phos-tag ™ 與PVDF 膜親和力更高，因此建議用PVDF 膜。

Q. 可以使用免疫印跡嗎？
A. 可以，但由于轉(zhuǎn)膜效果不好，必須用EDTA 處理除去凝膠中的金屬離子。
方法： 把凝膠放入含有 10 mmol/L 的 EDTA 緩沖液（25 mmol/L Tris, 192 mmol/L Glycine, 10%
MeOH）中，在搖床上緩慢搖動(dòng)10 分鐘。更換EDTA 緩沖液，重復(fù)操作3 次。隨后將凝膠放入不含有
EDTA 的緩沖液（25 mmol/l Tris, 192 mmol/l Glycine, 10 %MeOH）中，搖動(dòng)10 分鐘，最后將凝膠轉(zhuǎn)
移至PVDF 膜或者NC 膜上。
※ 如果轉(zhuǎn)膜效果仍然不理想，可多進(jìn)行幾次EDTA 處理或者增加EDTA 的濃度，或者適當(dāng)優(yōu)化轉(zhuǎn)膜方法等。

References ?參考文獻(xiàn)：

1. 1. “Recognition of phosphate monoester dianion by an alkoxide-bridged dinuclear zinc (II) complex”, E. Kinoshita, M. Takahashi, H. Takeda, M. Shiro, and T. Koike, Dalton Trans., 21, 1189-1193 (2004).

1. 1. “Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, K. Takiyama, and T. Koike, Mol. Cell.
      Proteomics, 5, 749-757 (2006).

1. 1. “A single nucleotide polymorphism genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Anal. Biochem., 361, 294-298 (2007).

1. 1. “Label-free kinase profiling using phosphate affinity polyacrylamide gel electrophoresis”, E. Kinoshita-Kikuta, Y. Aoki, E. Kinoshita, and T. Koike, Mol. Cell. Proteomics, 6, 356-366 (2007).

1. 1. “Separation of a phosphorylated-His protein using phosphate-affinity Polyacrylamide gel”, S. Yamada, H. Nalkamura, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and Y. Shiro, Anal. Biochem., 360, 160-162 (2007).

1. 1. “A mobility-shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis”, E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike, Anal. Biochem., 378, 102-104 (2008).

1. 1. “Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, M. Matsubara, S. Yamada, H. Nakamura, Y. Shiro, Y. Aoki, K. Okita, and T. Koike, Proteomics, 8, 2994-3003 (2008).

1. 1. “FANCI phosphorylation functions as a molecular switch to turn on the Fanconi anemia pathway”, M. Ishiai, H. Kitao, A. Smogorzewska, J. Tomida, A. Kinomura, E. Uchida, A. Saberi, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, S. Tashiro, S. J. Elledge, and M. Takata, Nature Struct. Mol. Biol., 15, 1138-1146 (2008).

1. 1. “Two-dimensional phosphate affinity gel electrophoresis for the analysis of phosphoprotein isotypes”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, M. Matsubara, Y. Aoki, S. Ohie, Y. Mouri, and T. Koike, Electrophoresis, 30, 550-559 (2009).

1. 1. “Phosphate-affinity Gel Electrophoresis Using a Phos-tag Molecule for Phosphoproteome Study”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Current Proteomics, 6, 104-121 (2009).

1. 1. “Mobility shift detection of phosphorylation on large proteins using a Phos-tag SDS-PAGE gel strengthened with agarose”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, H. Ujihara, and T. Koike, Proteomics, 9, 4098-101 (2009).
2. “Separation and detection of large phosphoproteins by using Phos-tag SDS-PAGE”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Nature Protocols, 4, 1513-21 (2009).