蛋白磷酸化研究的預(yù)制膠

SuperSep Phos-tag

SuperSep Phos-tag是研究蛋白磷酸化的方法，無需特異性磷酸化抗體或者同位素標(biāo)記。

◆SuperSep Phos-tag

Phos-tag?是一種預(yù)制膠，預(yù)先加入了50 μmol/L的Phostag? Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預(yù)制膠中含有鋅作為金屬離子，在中心凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好，得到的帶條結(jié)果也很整齊。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離。

分離后，膠可用于考馬斯亮藍(lán)染色，免疫印跡和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。

◆Phos-tag SDS-PAGE 的原理

◆在HighWire Search 上搜索到的論文數(shù)

◆運(yùn)用

利用p35的丙氨酸突變體確定Cdk5 激活p35的磷酸化位點(diǎn)

p35常見的磷酸化位點(diǎn)是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位點(diǎn)往往會(huì)發(fā)生丙氨酸突變，產(chǎn)生3種突變體（Ser8突變體：S8A，Thr138突變體：T138A，Ser8和Thr138雙突變體：2A）。這3種突變體、野生型p35、Cdk5和沒有激酶活性的Cdk5都來源于COS-7細(xì)胞。這些細(xì)胞裂解液用Phos-tag? SDS-PAGE和Western blotting 進(jìn)行檢測（檢測抗體：p35抗體）。

100 μM Phos-tag ? 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝膠

可明確磷酸化位點(diǎn)和條帶遷移率的關(guān)系！

– 泳道1（條帶L2和L4）和泳道5（條帶M1）：p35在Cdk5的作用下發(fā)生了磷酸化；

– 泳道1（條帶L2和L4）和泳道3（條帶L2和L4）：在無激酶活性Cdk5的作用下，大約有一半p35蛋白在Thr138位點(diǎn)

發(fā)生磷酸化，同樣在138位發(fā)生突變的p35蛋白亦是如此。

–?泳道5 （條帶M1）和泳道6（條帶L3和L4）：Ser8和Thr138是主要的磷酸化位點(diǎn)；

– 泳道5（條帶M1）、泳道7（條帶L1和L2）和泳道8（條帶M2）：條帶M1是Ser8和Thr138都發(fā)生磷酸化的條帶；

條帶M2是只有Ser8磷酸化的條帶；條帶L1和L2是只有Thr138磷酸化的條帶。

※ 條帶L1和L3中的X 是不確定哪個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化的條帶；

※?條帶L4是非磷酸化的p35。

【參考文獻(xiàn)】

Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ? SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 – 1143.

【結(jié)果提供】

理化學(xué)研究所 腦科學(xué)綜合研究中心 回路功能研究核心 記憶功能研究團(tuán)隊(duì) 細(xì)川智永（Dr. T. Hosokawa）

首都大學(xué)東京 理工學(xué)研究科 生命科學(xué)專業(yè) 神經(jīng)分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）

檢測含有Dnmt1磷酸化激酶的片段

我們可以確定在片段中含有目的激酶！

①?采用親和色譜法從鼠腦提取液中純化GST-Dnmt1（1-290）結(jié)合蛋白

② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1（1-290）作為體外激酶實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)底物

④ Phos-tag ?SDS-PAGE 用于Western blotting，確定遷移條帶中每個(gè)片段的激酶活性

【參考文獻(xiàn)】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J.,

【結(jié)果提供】

高知大學(xué) 綜合研究中心 生命、功能物質(zhì)部門 實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)機(jī)器設(shè)施 杉山康憲（Dr. Y. Sugiyama）

香川大學(xué) 農(nóng)學(xué)部 應(yīng)用生物科學(xué)科 動(dòng)物功能生化學(xué)研究室 龜下勇（Dr. I. Kameshita）

二維電泳中的應(yīng)用：分析hnRNP K磷酸化異構(gòu)體

小鼠巨噬細(xì)胞J774.1 經(jīng)LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到hnRNP K。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是Phos-tag ? SDS-PAGE，可分離hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點(diǎn)代表不同的亞型或修飾蛋白。

同一個(gè)等電點(diǎn)的位置上，不同位點(diǎn)發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來

（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【參考文獻(xiàn)】

? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【結(jié)果提供】

橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）

理化學(xué)研究所RCAI 小原收

◆備注

樣品制備：

Phos-tag SDS-PAGE對于蛋白樣品中的雜質(zhì)非常敏感，尤其是螯合劑，釩酸，無機(jī)鹽，表面活性劑這類物質(zhì)。

強(qiáng)烈建議在Phos-tag SDS-PAGE之前通過TCA沉淀或滲析法降低雜質(zhì)含量。

轉(zhuǎn)膜前處理：

另一個(gè)必須的步驟是在轉(zhuǎn)膜前，用EDTA去除凝膠中的金屬離子（Mn2+或者Zn2+）；

該步驟可提高蛋白的轉(zhuǎn)膜效率。

●　分別準(zhǔn)備10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 兩種1x transfer buffer。

●　將凝膠浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，至少20分鐘，溫和搖晃。更換新緩沖液，重復(fù)3次。

●　將凝膠浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，10分鐘，溫和搖晃。

●　轉(zhuǎn)膜操作*。

* 建議用濕法轉(zhuǎn)膜，以提高轉(zhuǎn)膜效率。

◆質(zhì)量控制

每一批SuperSep Phos-tag?，出廠前均根據(jù)其產(chǎn)品規(guī)格進(jìn)行測試，以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他們的分離成都在正常參數(shù)內(nèi)。

◆產(chǎn)品信息

用于Bio-Rad伯樂電泳儀

貨號(hào)	品名	電泳儀	規(guī)格
198-17981	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm	Mini-PROTEAN? Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.)	5 塊
195-17991	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm		5 塊

用于Life Technologies電泳儀

貨號(hào)	品名	電泳儀	規(guī)格
192-18001	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm	XCell SureLock? Mini-Cell (Life Technologies, Inc.)	5 塊
199-18011	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm		5 塊

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品規(guī)格
193-16711	SuperSep?Phos-tag???(50?μmol/L),?10%,?13?well Phos-tag?13孔10%預(yù)制膠	5塊
190-16721	SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?10%,?17?well Phos-tag?17孔10%預(yù)制膠	5塊
195-16391	SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?12.5%,?13?well Phos-tag?13孔12.5%預(yù)制膠	5塊
193-16571	SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?12.5%,?17?well Phos-tag?17孔12.5%預(yù)制膠	5塊
193-16691	SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?15%,?13?well Phos-tag?13孔15%預(yù)制膠	5塊
196-16701	SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?15%,?17?well Phos-tag?17孔15%預(yù)制膠	5塊
197-16851	SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?17.5%,?13?well Phos-tag?13孔17.5%預(yù)制膠	5塊
194-16861	SuperSep?Phos-tag??(50?μmol/L),?17.5%,?17?well Phos-tag?17孔17.5%預(yù)制膠	5塊
198-17981	SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?7.5%,?17well,?83×100×3.9mm Phos-tag??預(yù)制膠，BioRad型	5塊
195-17991	SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?12.5%,?17well,?83×100×3.9mm Phos-tag??預(yù)制膠，BioRad型	5塊
192-18001	SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?7.5%,?17well,?100×100×6.6mm Phos-tag??預(yù)制膠，Life?Technologies型	5塊
199-18011	SuperSep??Phos-tag??(50μmol/l),?12.5%,?17well,?100×100×6.6mm Phos-tag??預(yù)制膠，Life?Technologies型	5塊