產(chǎn)品編號(hào)
JJP70
Human Leptin ELISA Kit
96次
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的Human Leptin ELISA Kit (Human Leptin Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人瘦素酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測(cè)人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Leptin的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果表明，最小檢出量為26.6pg/ml，與小鼠Leptin和大鼠Leptin等均沒(méi)有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
人瘦素蛋白(Leptin)是一種分子量在16kDa，長(zhǎng)度為146個(gè)氨基酸的非糖基化多肽，主要參與調(diào)節(jié)脂肪組織體積和能量平衡。在人和小鼠體內(nèi)，瘦素基因(OB)的失活突變會(huì)導(dǎo)致肥胖的發(fā)生。成熟的人Leptin與小鼠及大鼠Leptin分別具有87%和84%的氨基酸同源性。體內(nèi)唯一能夠產(chǎn)生Leptin的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞，Leptin的產(chǎn)生受到激素、細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響。例如胰島素和糖皮質(zhì)激素會(huì)增強(qiáng)Leptin的表達(dá)，然而兒茶酚胺會(huì)抑制Leptin的表達(dá)。Leptin通常以游離形式存在于血漿中，能夠穿過(guò)血腦屏障，也能夠隨乳汁分泌出來(lái)。
人Leptin受體(ObR或LEPR)是一種分子量在150kDa，長(zhǎng)度為1144個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白，屬于I類細(xì)胞因子受體家族中IL-6受體家族。ObR經(jīng)過(guò)酶切作用后會(huì)產(chǎn)生多種變體(ObRa、b、c、d)，每種變體具有不同長(zhǎng)度的胞內(nèi)段，同時(shí)還包括游離形式的受體ObRe。ObRb，具有完成胞內(nèi)段，主要表達(dá)在下丘腦弓狀細(xì)胞核，是信號(hào)傳遞的必需分子。ObRa表達(dá)較為廣泛，其與ObRc、ObRd一起被認(rèn)為是具有調(diào)節(jié)Leptin結(jié)合和內(nèi)吞作用的受體，卻并不參與信號(hào)傳遞，它們的胞內(nèi)段與ObRb相比較短。當(dāng)與Leptin二聚體結(jié)合后，ObRb二聚體會(huì)與ObRa、ObRc或ObRd之一形成四聚體復(fù)合物，從而傳遞信號(hào)。ObRb的突變會(huì)產(chǎn)生肥胖表型的大鼠或小鼠，小鼠的受體基因突變發(fā)生在胞質(zhì)區(qū)，而大鼠的基因突變則發(fā)生在受體的胞外域。Leptin會(huì)產(chǎn)生多種相反的濃度依賴性作用，例如Leptin能誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)POMC、從而減少食物攝取；反之通過(guò)誘導(dǎo)NpY和AgRP的表達(dá)則會(huì)增加食物的攝取。
Leptin本質(zhì)上來(lái)說(shuō)是一種“饑餓信號(hào)”，Leptin濃度較低就會(huì)增強(qiáng)食欲減少能量消耗。在脂肪細(xì)胞體積增大時(shí)就會(huì)增加Leptin的分泌，從而導(dǎo)致食欲降低，能量消耗增多。然而，肥胖人群通常會(huì)有“瘦素抵抗”現(xiàn)象出現(xiàn)，這一部分是由于高濃度的甘油三酯造成的Leptin血-腦轉(zhuǎn)運(yùn)體的飽和，另一部分是由于細(xì)胞對(duì)Leptin的響應(yīng)降低所造成。還有很少一部分肥胖人群是由于遺傳性的Leptin缺陷導(dǎo)致。Leptin缺陷同樣會(huì)影響到免疫系統(tǒng)，會(huì)降低Th1細(xì)胞的應(yīng)答，增加感染的發(fā)生幾率。因節(jié)食等多種原因而過(guò)度消瘦所造成的Leptin缺陷同樣也會(huì)對(duì)青春期發(fā)育產(chǎn)生影響。
瘦素受體與Leptin結(jié)合后通過(guò)招募JAK2使瘦素受體上的三個(gè)關(guān)鍵酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，磷酸化的Tyr位點(diǎn)能夠招募STAT3并使之磷酸化激活，隨后發(fā)生二聚化進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮功能，啟動(dòng)SOCS3和NpY等靶基因的表達(dá)；另外，SOCS3蛋白又能抑制激活的JAK2-STAT3通路，從而實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)。
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich?ELISA)檢測(cè)樣品中人Leptin的濃度，其原理見(jiàn)圖1。人Leptin特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時(shí)，其中的人Leptin會(huì)與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗人Leptin抗體后，生物素化抗人Leptin抗體與人Leptin結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Streptavidin?(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會(huì)與夾心的免疫復(fù)合物連接起來(lái)而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過(guò)氧化物酶就會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度值就能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。人Leptin濃度與A450值呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照樣品吸光度值，即可計(jì)算出樣品中人Leptin濃度。
圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。
一個(gè)包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，可以進(jìn)行96次檢測(cè)。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
JJP70-1
人Leptin抗體預(yù)包被板
8孔×12條
JJP70-2
樣品分析緩沖液
5ml
JJP70-3
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(5X)
10ml
JJP70-4
人Leptin標(biāo)準(zhǔn)品
2-4瓶
JJP70-5
人Leptin生物素化抗體
10ml
JJP70-6
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Streptavidin
10ml
JJP70-7
洗滌液(20X)
30ml
JJP70-8
TMB溶液
10ml
JJP70-9
終止液
5ml
JJP70-10
封板膜(透明)
2張
JJP70-11
封板膜(白色)
2張
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說(shuō)明書
1份
保存條件：
標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個(gè)月內(nèi)有效；試劑盒其它組分4℃保存6個(gè)月內(nèi)有效。除標(biāo)準(zhǔn)品外，試劑盒其它組分嚴(yán)禁凍存。
注意事項(xiàng)：
由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請(qǐng)以實(shí)際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請(qǐng)室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請(qǐng)勿再次使用。
TMB溶液請(qǐng)勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時(shí)，請(qǐng)注意每個(gè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
由于本試劑盒均經(jīng)過(guò)獨(dú)立測(cè)試，所以請(qǐng)勿混用不同貨號(hào)和不同批次的試劑盒組分，即使是同種試劑盒不同批次的試劑盒組分也不能混用。多個(gè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)獨(dú)立使用各個(gè)試劑盒中的試劑，請(qǐng)勿使用不同試劑盒中相同名稱的組分。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕晃動(dòng)整個(gè)96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會(huì)導(dǎo)致最終檢測(cè)到的吸光度顯著下降。
洗滌過(guò)程非常重要，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時(shí)建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測(cè)結(jié)果的可信度。
加樣過(guò)程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。