使用miScript PCR System，對(duì)包含miRNA的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
上海金畔生物科技有限公司提供凱杰Qiagen miScript II RT Kit (12) 218160，品質(zhì)保證，價(jià)格優(yōu)惠，全國(guó)聯(lián)保，歡迎咨詢。
靈敏和特異性的檢測(cè)miRNA
利用單一cDNA定量檢測(cè)多種miRNA
利用同一cDNA定量檢測(cè)miRNA和mRNA
利用同一cDNA定量檢測(cè)成熟miRNA和miRNA前體
專有技術(shù)合成RNA，評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄效率
miScript II RT Kit是miScript PCR System的重要組成部分，用于miRNA定量檢測(cè)。配合miScript SYBR Green PCR Kit和miScript PCRarrays（miRNome或Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays）或所需的檢測(cè)（用于miRNA或其他非編碼RNA的miScript Primer Assays、用于miRNA前體的miScript Precursor Assays或用于mRNA的QuantiTect Primer Assays），miScript II RT Kit合成的cDNA可作為real-time PCR 的模板。
Performance
miScript II RT Kit配合miScript PCR System的其他組分，靈敏和特異性地檢測(cè)并定量miRNA。由于許多miRNA表達(dá)水平低，靈敏度特別重要，以確保數(shù)據(jù)的可靠。miScript PCR System靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍廣和持續(xù)高擴(kuò)增率。其卓越的性能使得初次嘗試時(shí)即可獲得高度重復(fù)性結(jié)果（參見(jiàn)”Reproducible results in technical and biological replicates”）。
高特異性
miRNAs存在許多miRNA亞型家族，有些只是單個(gè)堿基的不同。這使得miRNA定量面臨很大挑戰(zhàn)。miScript PCR System可有效識(shí)別緊密相關(guān)的miRNA亞型，即使是只有單個(gè)堿基不同的miRNA也可（見(jiàn)表）。
miScript PCR System的特異性
| miRNA序列 | |
| Let-7b | UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU |
| Let-7c | UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU |
| miR-98 | UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU |
| Let-7d | AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU |
| Let-7e | UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU |
| Let-7a | UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU |
| Let-7f | UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU |
| Let-7g | UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU |
| Let-7i | UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU |
| 用于PCR的cDNA | Let-7b | Let-7c | miR-98 | Let-7d | Let-7e | Let-7a | Let-7f | Let-7g | Let-7i |
| Let-7b | 100.00 | 1.78 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7c | 0.54 | 100.00 | 0.00 | 0.00 | 1.01 | 0.12 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| miR-98 | 0.00 | 0.21 | 100.00 | 0.06 | 0.01 | 0.05 | 0.00 | 0.01 | 0.13 |
| Let-7d | 0.05 | 0.02 | 0.00 | 100.00 | 0.00 | 0.38 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7e | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 0.02 | 100.00 | 0.23 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7a | 0.07 | 0.64 | 0.00 | 0.54 | 3.86 | 100.00 | 0.06 | 0.04 | 0.02 |
| Let-7f | 0.55 | 0.12 | 0.01 | 0.11 | 0.03 | 1.05 | 100.00 | 0.14 | 0.13 |
| Let-7g | 0.58 | 0.17 | 0.01 | 0.08 | 0.00 | 0.04 | 0.01 | 100.00 | 0.17 |
| Let-7i | 0.13 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.10 | 100.00 |
Let-7亞型的RNA序列已列出。粗體有下劃線部分為堿基變化。使用miScript II RT Kit和miScript HiFlex Buffer，每個(gè)Let-7亞型（Let-7a-Let-7i和miR-98）的合成miRNAs用于cDNA合成反應(yīng)。相同的實(shí)驗(yàn)也可使用miScript HiSpec Buffer，獲得相同的結(jié)果（數(shù)據(jù)未列出）。不同cDNA的等分試樣作為real-time PCR反應(yīng)的模板，配合適合不同亞型miScript Primer Assay和miScript SYBR? Green PCR Kit使用。%相對(duì)檢測(cè)值為所有與miScript Primer Assays不匹配和匹配的CT值的差值（%相對(duì)檢測(cè)值= 2-ΔCT x 100）。其值表明miScript PCR System有效識(shí)別緊密相關(guān)的亞型家族的能力。
Principle
miScript PCR System應(yīng)用SYBR Green-based real-time PCR，能夠靈敏和特異性地進(jìn)行miRNA的定量和譜分析。miScript PCR System可以完成從RNA中合成cDNA及后續(xù)的real-time PCR檢測(cè)miRNAs涉及的所有步驟。
miScript PCR System包含以下組分：
miScript II RT Kit，可簡(jiǎn)單、單步合成cDNA。單個(gè)cDNA合成反應(yīng)可用于檢測(cè)數(shù)以百計(jì)的miRNAs。雙緩沖體系滿足使用real-time PCR進(jìn)行miRNA定量的獨(dú)特要求。
miScript SYBR Green PCR Kit，包含QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和反向引物miScript Universal Primer，配合miScript Primer Assay或miScript miRNA PCR Array進(jìn)行miRNAs檢測(cè)。
miScript Primer Assay或miScript Precursor Assay，前者為miRNA特異性正向引物，用于檢測(cè)成熟miRNAs。后者包含正向和反向引物，靶向作用于miRNA前體的頸環(huán)序列。該產(chǎn)品使用miRBase中的最新序列信息設(shè)計(jì)。
miScript miRNA PCR Array，miRNome或Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays被預(yù)先設(shè)定，單次使用的PCR孔板/孔盤可快速分析成熟miRNAs。
miScript miRNA PCR Array data analysis tool，免費(fèi)的基于網(wǎng)絡(luò)的工具，簡(jiǎn)化了用于miScript miRNA PCR Arrays相對(duì)定量的ΔΔCT方法。
miScript II RT Kit雙緩沖體系
miScript II RT Kit包含miScript Reverse Transcriptase Mix、10x miScript Nucleics Mix、5x miScript HiSpec Buffer和5x miScript HiFlex Buffer。miScript Reverse Transcriptase Mix是一種經(jīng)優(yōu)化的poly(A)聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合物。miScript Nucleics Mix包含dNTPs、rATP、oligo-dT引物和內(nèi)部合成RNA對(duì)照（miRNA逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照[miRTC]），可評(píng)估使用miScript miRNA PCR Arrays進(jìn)行譜分析實(shí)驗(yàn)的逆轉(zhuǎn)錄性能（獲取更多信息，請(qǐng)參考miScript miRNA PCR Array Handbook）。
miScript II RT Kit提供兩種緩沖液：miScript HiSpec Buffer和miScript HiFlex Buffer，滿足使用real-time PCR進(jìn)行miRNA定量研究的特別要求（參見(jiàn)”miScript II RT Kit buffers”）。miScript HiSpec Buffer配合miScript miRNA PCR Arrays和miScript Primer Assays進(jìn)行成熟miRNA譜分析和定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，提供理想的結(jié)果。miScript HiFlex Buffer適合于低通量miRNA定量實(shí)驗(yàn)，從同一樣本進(jìn)行如miRNA、mRNA和前體miRNA等不同種類的RNA的定量實(shí)驗(yàn)除外。
miScript HiSpec Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
使用miScript HiSpec Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，確保成熟miRNAs的選擇性轉(zhuǎn)化，miScript PCR Controls靶向轉(zhuǎn)至cDNA。使用oligo-dT引物，成熟miRNAs通過(guò)poly(A)聚合酶加尾后，被逆轉(zhuǎn)錄至cDNA（參見(jiàn)”Selective conversion of mature miRNAs into cDNA in miScript HiSpec Buffer”）。加尾和逆轉(zhuǎn)錄在同一試管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行。oligo-dT引物有一個(gè)3’退化錨點(diǎn)和一個(gè)在5’端的通用標(biāo)簽序列，可在real-time PCR步驟擴(kuò)增成熟miRNA。miScript Primer Assays配合miScript SYBR Green PCR Kit，確保通過(guò)real-time PCR靈敏、特異性的定量miRNA。加尾和通用標(biāo)簽保證miScript Primer Assays不會(huì)檢測(cè)到基因組DNA。
miScript HiFlex Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
使用miScript HiFlex Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可使所有種類的RNA轉(zhuǎn)化至cDNA（參見(jiàn)”Simultaneous conversion of all RNA species into cDNA in miScript HiFlex Buffer”）。使用oligo-dT引物，成熟miRNAs通過(guò)poly(A) 聚合酶加尾后，被逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。加尾和逆轉(zhuǎn)錄在同一試管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行。oligo-dT引物有一個(gè)3’退化錨點(diǎn)和一個(gè)在5’端的通用標(biāo)簽序列，可在real-time PCR步驟擴(kuò)增成熟miRNA。miScript Primer Assays配合miScript SYBR Green PCR Kit，確保通過(guò)real-time PCR定量miRNA。加尾和通用標(biāo)簽確保miScript Primer Assays不會(huì)檢測(cè)到基因組DNA。其它種類RNA（包括miRNA前體、其它非編碼RNA和mRNA）使用oligo-dT和隨機(jī)引物轉(zhuǎn)化至cDNA。配合miScript SYBR Green PCR Kit，使用合適的檢測(cè)進(jìn)行real-time PCR的RNAs檢測(cè)（如用于非編碼RNA檢測(cè)的miScript Primer Assays 、用于miRNA前體檢測(cè)的miScript Precursor Assays和用于mRNA檢測(cè)的QuantiTect Primer Assays）。
Procedure
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作簡(jiǎn)單。包含miRNA的總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的起始材料。逆轉(zhuǎn)錄是一個(gè)簡(jiǎn)單的流程，包括在37oC條件下進(jìn)行1個(gè)小時(shí)的孵育反應(yīng)及在95oC條件下的簡(jiǎn)單孵育后進(jìn)行的滅活反應(yīng)。
Applications
miScript II RT Kit作為miScript PCR System的一部分，用于：
成熟miRNA定量檢測(cè)和譜分析
同時(shí)檢測(cè)miRNA和mRNA
同時(shí)檢測(cè)成熟miRNA和miRNA前體
檢測(cè)snoRNA和其他非編碼RNA