使用miScript PCR System，對包含miRNA的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
上海金畔生物科技有限公司提供凱杰Qiagen miScript II RT Kit (12) 218160，品質(zhì)保證，價格優(yōu)惠，全國聯(lián)保，歡迎咨詢。
靈敏和特異性的檢測miRNA
利用單一cDNA定量檢測多種miRNA
利用同一cDNA定量檢測miRNA和mRNA
利用同一cDNA定量檢測成熟miRNA和miRNA前體
專有技術(shù)合成RNA，評估逆轉(zhuǎn)錄效率
miScript II RT Kit是miScript PCR System的重要組成部分，用于miRNA定量檢測。配合miScript SYBR Green PCR Kit和miScript PCRarrays（miRNome或Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays）或所需的檢測（用于miRNA或其他非編碼RNA的miScript Primer Assays、用于miRNA前體的miScript Precursor Assays或用于mRNA的QuantiTect Primer Assays），miScript II RT Kit合成的cDNA可作為real-time PCR 的模板。
Performance
miScript II RT Kit配合miScript PCR System的其他組分，靈敏和特異性地檢測并定量miRNA。由于許多miRNA表達(dá)水平低，靈敏度特別重要，以確保數(shù)據(jù)的可靠。miScript PCR System靈敏度高、動態(tài)范圍廣和持續(xù)高擴(kuò)增率。其卓越的性能使得初次嘗試時即可獲得高度重復(fù)性結(jié)果（參見”Reproducible results in technical and biological replicates”）。
高特異性
miRNAs存在許多miRNA亞型家族，有些只是單個堿基的不同。這使得miRNA定量面臨很大挑戰(zhàn)。miScript PCR System可有效識別緊密相關(guān)的miRNA亞型，即使是只有單個堿基不同的miRNA也可（見表）。
miScript PCR System的特異性
| miRNA序列 | |
| Let-7b | UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU |
| Let-7c | UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU |
| miR-98 | UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU |
| Let-7d | AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU |
| Let-7e | UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU |
| Let-7a | UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU |
| Let-7f | UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU |
| Let-7g | UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU |
| Let-7i | UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU |
| 用于PCR的cDNA | Let-7b | Let-7c | miR-98 | Let-7d | Let-7e | Let-7a | Let-7f | Let-7g | Let-7i |
| Let-7b | 100.00 | 1.78 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7c | 0.54 | 100.00 | 0.00 | 0.00 | 1.01 | 0.12 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| miR-98 | 0.00 | 0.21 | 100.00 | 0.06 | 0.01 | 0.05 | 0.00 | 0.01 | 0.13 |
| Let-7d | 0.05 | 0.02 | 0.00 | 100.00 | 0.00 | 0.38 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7e | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 0.02 | 100.00 | 0.23 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7a | 0.07 | 0.64 | 0.00 | 0.54 | 3.86 | 100.00 | 0.06 | 0.04 | 0.02 |
| Let-7f | 0.55 | 0.12 | 0.01 | 0.11 | 0.03 | 1.05 | 100.00 | 0.14 | 0.13 |
| Let-7g | 0.58 | 0.17 | 0.01 | 0.08 | 0.00 | 0.04 | 0.01 | 100.00 | 0.17 |
| Let-7i | 0.13 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.10 | 100.00 |
Let-7亞型的RNA序列已列出。粗體有下劃線部分為堿基變化。使用miScript II RT Kit和miScript HiFlex Buffer，每個Let-7亞型（Let-7a-Let-7i和miR-98）的合成miRNAs用于cDNA合成反應(yīng)。相同的實驗也可使用miScript HiSpec Buffer，獲得相同的結(jié)果（數(shù)據(jù)未列出）。不同cDNA的等分試樣作為real-time PCR反應(yīng)的模板，配合適合不同亞型miScript Primer Assay和miScript SYBR? Green PCR Kit使用。%相對檢測值為所有與miScript Primer Assays不匹配和匹配的CT值的差值（%相對檢測值= 2-ΔCT x 100）。其值表明miScript PCR System有效識別緊密相關(guān)的亞型家族的能力。
Principle
miScript PCR System應(yīng)用SYBR Green-based real-time PCR，能夠靈敏和特異性地進(jìn)行miRNA的定量和譜分析。miScript PCR System可以完成從RNA中合成cDNA及后續(xù)的real-time PCR檢測miRNAs涉及的所有步驟。
miScript PCR System包含以下組分：
miScript II RT Kit，可簡單、單步合成cDNA。單個cDNA合成反應(yīng)可用于檢測數(shù)以百計的miRNAs。雙緩沖體系滿足使用real-time PCR進(jìn)行miRNA定量的獨特要求。
miScript SYBR Green PCR Kit，包含QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和反向引物miScript Universal Primer，配合miScript Primer Assay或miScript miRNA PCR Array進(jìn)行miRNAs檢測。
miScript Primer Assay或miScript Precursor Assay，前者為miRNA特異性正向引物，用于檢測成熟miRNAs。后者包含正向和反向引物，靶向作用于miRNA前體的頸環(huán)序列。該產(chǎn)品使用miRBase中的最新序列信息設(shè)計。
miScript miRNA PCR Array，miRNome或Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays被預(yù)先設(shè)定，單次使用的PCR孔板/孔盤可快速分析成熟miRNAs。
miScript miRNA PCR Array data analysis tool，免費的基于網(wǎng)絡(luò)的工具，簡化了用于miScript miRNA PCR Arrays相對定量的ΔΔCT方法。
miScript II RT Kit雙緩沖體系
miScript II RT Kit包含miScript Reverse Transcriptase Mix、10x miScript Nucleics Mix、5x miScript HiSpec Buffer和5x miScript HiFlex Buffer。miScript Reverse Transcriptase Mix是一種經(jīng)優(yōu)化的poly(A)聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合物。miScript Nucleics Mix包含dNTPs、rATP、oligo-dT引物和內(nèi)部合成RNA對照（miRNA逆轉(zhuǎn)錄對照[miRTC]），可評估使用miScript miRNA PCR Arrays進(jìn)行譜分析實驗的逆轉(zhuǎn)錄性能（獲取更多信息，請參考miScript miRNA PCR Array Handbook）。
miScript II RT Kit提供兩種緩沖液：miScript HiSpec Buffer和miScript HiFlex Buffer，滿足使用real-time PCR進(jìn)行miRNA定量研究的特別要求（參見”miScript II RT Kit buffers”）。miScript HiSpec Buffer配合miScript miRNA PCR Arrays和miScript Primer Assays進(jìn)行成熟miRNA譜分析和定量實驗時，提供理想的結(jié)果。miScript HiFlex Buffer適合于低通量miRNA定量實驗，從同一樣本進(jìn)行如miRNA、mRNA和前體miRNA等不同種類的RNA的定量實驗除外。
miScript HiSpec Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實驗
使用miScript HiSpec Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，確保成熟miRNAs的選擇性轉(zhuǎn)化，miScript PCR Controls靶向轉(zhuǎn)至cDNA。使用oligo-dT引物，成熟miRNAs通過poly(A)聚合酶加尾后，被逆轉(zhuǎn)錄至cDNA（參見”Selective conversion of mature miRNAs into cDNA in miScript HiSpec Buffer”）。加尾和逆轉(zhuǎn)錄在同一試管內(nèi)同時進(jìn)行。oligo-dT引物有一個3’退化錨點和一個在5’端的通用標(biāo)簽序列，可在real-time PCR步驟擴(kuò)增成熟miRNA。miScript Primer Assays配合miScript SYBR Green PCR Kit，確保通過real-time PCR靈敏、特異性的定量miRNA。加尾和通用標(biāo)簽保證miScript Primer Assays不會檢測到基因組DNA。
miScript HiFlex Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實驗
使用miScript HiFlex Buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可使所有種類的RNA轉(zhuǎn)化至cDNA（參見”Simultaneous conversion of all RNA species into cDNA in miScript HiFlex Buffer”）。使用oligo-dT引物，成熟miRNAs通過poly(A) 聚合酶加尾后，被逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。加尾和逆轉(zhuǎn)錄在同一試管內(nèi)同時進(jìn)行。oligo-dT引物有一個3’退化錨點和一個在5’端的通用標(biāo)簽序列，可在real-time PCR步驟擴(kuò)增成熟miRNA。miScript Primer Assays配合miScript SYBR Green PCR Kit，確保通過real-time PCR定量miRNA。加尾和通用標(biāo)簽確保miScript Primer Assays不會檢測到基因組DNA。其它種類RNA（包括miRNA前體、其它非編碼RNA和mRNA）使用oligo-dT和隨機引物轉(zhuǎn)化至cDNA。配合miScript SYBR Green PCR Kit，使用合適的檢測進(jìn)行real-time PCR的RNAs檢測（如用于非編碼RNA檢測的miScript Primer Assays 、用于miRNA前體檢測的miScript Precursor Assays和用于mRNA檢測的QuantiTect Primer Assays）。
Procedure
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作簡單。包含miRNA的總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的起始材料。逆轉(zhuǎn)錄是一個簡單的流程，包括在37oC條件下進(jìn)行1個小時的孵育反應(yīng)及在95oC條件下的簡單孵育后進(jìn)行的滅活反應(yīng)。
Applications
miScript II RT Kit作為miScript PCR System的一部分，用于：
成熟miRNA定量檢測和譜分析
同時檢測miRNA和mRNA
同時檢測成熟miRNA和miRNA前體
檢測snoRNA和其他非編碼RNA
