化學穩(wěn)定性高的耐光性近紅外熒光染料

PREX710-NHS (Super PhotoStable Dye)

PREX710是一種高體內(nèi)穩(wěn)定性的耐光性近紅外染料，可用于體內(nèi)熒光成像、單分子成像、抑制葉綠體自發(fā)熒光影響的植物成像以及多重染色。本試劑具有NHS酯結(jié)構(gòu)，可特異性標記氨基。

※ 本產(chǎn)品基于名古屋大學多變生物分子研究所（ITbM）山口茂弘教授、多喜正泰特任準教授的研究成果，由funakoshi株式會社進行商品化

※ 并銷售。

※ 本產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。

◆近紅外染料在成像中的優(yōu)點及現(xiàn)有染料的問題

熒光成像是現(xiàn)代生物學中必不可少的技術(shù)，目前已研發(fā)出各種熒光染料。其大部分為可以被可見光激發(fā)的熒光染料，其中藍色、綠色及紅色熒光染料已得到廣泛使用。但是，使用可見光作為激發(fā)光對生物樣品進行熒光成像時，存在以下3個主要的問題：

① 光損害性：由于光能量較高，長時間會對觀察對象產(chǎn)生光損害，從而影響實時成像。

② 自發(fā)熒光：在可見光激發(fā)下，除熒光染料外還可能會觀察到生物物質(zhì)來源的自發(fā)熒光。

③ 組織透過性：可見光的組織透過性低，在個體水平的成像中難以觀察到組織深處。

為解決上述問題，波長比可見光更長的近紅外染料（Near Infrared dye; NIR dye）備受期待。近紅外染料一般使用700~900 nm范圍內(nèi)的波長作為激發(fā)光。長波長光不僅能量低，可抑制光毒性，并且由于生物物質(zhì)對近紅外波長的吸收小，所以自發(fā)熒光小，組織滲透性高，而被稱為“生物之窗”。傳統(tǒng)的近紅外染料大部分都以花青素為基本骨架。由于花青素染料系（典型例子：吲哚菁綠）在生物體內(nèi)的化學穩(wěn)定性低，且缺乏光穩(wěn)定性，以及在生物樣品中分解快、褪色快，導(dǎo)致在生物樣品中的熒光成像不充分。

PREX710作為一種新型的近紅外染料，由于使用的是向氧雜蒽骨架引入氧化膦基團的新型骨架，而不是花青素骨架，所以能維持在血液中的化學穩(wěn)定性，且表現(xiàn)出較高的光穩(wěn)定性。其有望成為新型的近紅外染料，應(yīng)用于如體內(nèi)成像等生物樣品的長時間成像。

◆PREX710-NHS染料結(jié)構(gòu)

本試劑將NHS酯引入到PREX710染料的結(jié)構(gòu)中?？蓪Ω鞣N含氨基的樣品進行標記。

參考文獻

Grzybowski, M., et al., Angew. Chem. Int. Ed., 57(32), 10137～10141 (2018). [PMID: 29984448]
A Highly Photostable Near-Infrared Labeling Agent Based on a Phospha-rhodamine for Long-Term and Deep Imaging.

◆特點

●　激發(fā)/熒光波長：710 nm/740 nm

●　量子產(chǎn)率：0.12

●　與現(xiàn)有的近紅外熒光染料相比，表現(xiàn)出較高的光穩(wěn)定性。

●　與現(xiàn)有的花青素系近紅外熒光染料相比，在水中和生物樣品中穩(wěn)定。

●　在pH4~pH10的范圍內(nèi)，幾乎不受pH的影響。

●　由于含有NHS酯結(jié)構(gòu)，可標記含氨基的樣品。

●　可用于體內(nèi)成像和單分子成像。

●　用于植物時，可在不受葉綠體自發(fā)熒光的影響下進行觀察。

●　可與常見的藍色熒光染料、綠色熒光染料、紅色熒光染料組合使用，進行4重染色。

◆標記方法概要

本產(chǎn)品為棕色小瓶包裝，內(nèi)含1 mg的PREX710-NHS（綠色），為了穩(wěn)定NHS酯，以氬氣填充。一旦開封，NHS酯可能會逐漸水解，建議在本試劑開封和溶解后立即使用。

1.  小瓶開封后，請立即用DMSO或DMF進行溶解。

1.  注：由于在水中會發(fā)生水解反應(yīng)，不建議溶于水。建議使用脫水級的DMSO或DMF。另外，由于NHS酯在溶液中不穩(wěn)定，儲備溶液請在標記樣品前現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.  因為儲備溶液制備后在保存過程中可能會失去標記活性，因此不建議對其進行保存。

2. 將需要標記的含氨基樣品溶解于0.1 M的碳酸鹽緩沖液 (NaHCO₃/Na₂CO₃，pH 8.3) 。

1.  注：可用磷酸緩沖液PBS代替，但不建議使用含氨基的緩沖劑（如Tris，甘氨酸等），因為NHS可能會與緩沖劑反應(yīng)而使其失活。

3. 將PREX710-NHS溶液與樣品溶液混合，使其至少反應(yīng)1 h。

4. 通過凝膠過濾或超濾法去除未反應(yīng)的PREX710染料。

1.  注：染料量及樣品使用量可視情況進行優(yōu)化。

標記注意事項

NHS酯與氨基反應(yīng)時溶液的pH很重要，pH 8.2-8.3最為適合。當pH小于8時，氨基會質(zhì)子化導(dǎo)致反應(yīng)效率降低；當pH大于8.5時，NHS酯會發(fā)生水解而失去標記活性。

◆參考數(shù)據(jù)

■　PREX710的激發(fā) · 熒光光譜

■　激發(fā)光譜（藍色），熒光光譜（紅色）

■　PREX710的pH穩(wěn)定性

為了評估PREX710的pH穩(wěn)定性，分別檢測了10 h后pH在4.2、7.4、10.3中712 nm處吸光度隨時間的變化。在以上的pH條件下，幾乎沒有觀察到吸光度的衰減，由此可推斷，本試劑在生物體內(nèi)的pH范圍（pH4~10）中，不受pH影響。

■　PREX710的光穩(wěn)定性

為了評估PREX710的光穩(wěn)定性，將PREX710溶解于PBS中，使用氙燈（300 W）間歇照射后觀察712 nm處吸光度的衰減情況。PREX710即使在氙燈下連續(xù)曝光2 h，也完全未觀察到吸光度的變化。

■　PREX710在血清中的穩(wěn)定性

為了評估PREX710在血液中的穩(wěn)定性，將PREX710溶解于FBS（100%）中，觀察12 h后在712 nm處的吸光度變化。PREX710在至少12小時內(nèi)，在血清中的吸光度幾乎沒有變化，表明在血清中的穩(wěn)定性高。

■　比較蛋白標記過程中的光穩(wěn)定性

作為標記模型，分別使用PREX710-NHS、花青素系競爭性染料A-NHS以及競爭性染料C-NHS對IgG抗體進行標記，氙燈（300 W）間歇照射后觀察光穩(wěn)定性。在使用了花青素系競爭性染料A及競爭性染料C的標記中可觀察到吸光度迅速衰減，但PREX710即使在IgG抗體標記狀態(tài)下，吸光度在長時間的光照射下也幾乎不發(fā)生變化。

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

■　小鼠的體內(nèi)血管成像

制備使用PREX710-NHS標記的氨基葡聚糖（平均分子量為70,000），尾靜脈給藥于4周齡的小鼠，使用共聚焦激光顯微鏡（激發(fā)/熒光波長=638 nm/667~733 nm）對使用開顱法處理的腦血管進行深部成像。PREX710在血液中可長時間穩(wěn)定，由于它可在不易受血紅蛋白自發(fā)熒光影響的波長下激發(fā)，成功地進行了清晰的腦血管深部成像，解決了血液成像的一大難題。

（以上數(shù)據(jù)由愛媛大學大學院醫(yī)學系研究科 今村健志研究室提供）

■　植物成像

使用經(jīng)PREX710-NHS標記的八聚精氨酸R8（PREX710-R8），對小立碗蘚（Physcomitrella patens）的原生質(zhì)體細胞壁進行染色，并用熒光顯微鏡觀察。在703~717 nm/754~816 nm的激發(fā)/熒光波長下觀察PREX710-R8，檢測到在300~400 nm/>420 nm的激發(fā)/熒光波長下葉綠素為自發(fā)熒光。通過使用PREX710可以區(qū)分葉綠體的自發(fā)熒光，從而檢測到清晰的信號。由于PREX710不易受葉綠體的自發(fā)熒光影響，適用于植物成像。

■　使用PREX710的單分子成像

構(gòu)建單分子成像的模型，分別制備經(jīng)PREX710-NHS和花青素系競爭性染料A-NHS標記的抗生物素蛋白，隨后通過生物素偶聯(lián)固定在載玻片上。點上的信號是由單個抗生物素分子引起的熒光信號。以10幀/秒的采集速度，120 s內(nèi)連續(xù)追蹤單分子的信號。觀察到花青素系競爭性染料A標記的各個信號會逐漸衰減，到40 s后熒光信號已幾乎完全消失；而經(jīng)PREX710標記的各個點信號即使在單分子水平下也能連續(xù)觀察120 s，并只觀察到了輕微的衰減。

（以上數(shù)據(jù)由理化學研究所 岡田康志研究室提供）