Superstar飛克超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 500ml品牌：JinPan | 貨號：EK-5008-500ml
ECL Western Blotting Substrate
【保存條件】
4℃避光保存 12 月
【概述】
超敏發(fā)光液用于檢測直接或間接標(biāo)記辣根過氧化物酶 HRP 的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。 用于 HRP 標(biāo)記抗體的 Western Blot 和 HRP 標(biāo)記探針的核酸雜交。由于采用了獨(dú)特的發(fā)光底物 系統(tǒng)，SuperStar ECL 超敏發(fā)光液是目前最靈敏的商業(yè)化熒光 ECL 檢測試劑（具有極高靈 敏度和高信噪比）；可在日光燈下進(jìn)行發(fā)光操作；發(fā)光迅速，熒光可使 X 光膠片感光達(dá) 12 小時以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測；可使用更高的抗體稀釋倍數(shù)(1:2000～1:10000)， 極其節(jié)省抗體。
【特點(diǎn)】
? 飛克級靈敏度 – 在硝酸纖維素或 PVDF 膜上檢測低至飛克量的目標(biāo)蛋白量
? 高信號穩(wěn)定性 – 孵育印跡在關(guān)鍵的 4 小時時間內(nèi)提供穩(wěn)定的信號持續(xù)時間，在最佳條 件下可產(chǎn)生長達(dá) 24 小時的光輸出
? 穩(wěn)定的試劑 – 8 小時工作溶液穩(wěn)定性; 在 4℃下 1 年的試劑盒穩(wěn)定性
? 更經(jīng)濟(jì)的抗體用量： 0.2 至 1.0μg/ mL 一抗（從 1 mg / mL 原液中 1：1000 至 1：5000 稀釋） 10 至 50 ng / mL 二級抗體（從 1 mg / mL 原液中 1：20,000 至 1：100,000 稀釋）
【操作方法】
1. 執(zhí)行常規(guī) SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜和 Western Blot 步驟。注意用 HRP 標(biāo)記 lgG 或用一抗-鏈 親和素-生物素-HRP 夾法。
2. Western Blot 最后一次洗膜的同時新鮮配制發(fā)光工作液：分別取 A:B=1:1 混合（如需要 1ml 發(fā)光液則取 500ul ECL A 液和 500ul ECL B 液混合），放入干凈容器中混合。建議立即使用 工作液，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。
3. 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發(fā)光工作液 (0.125ml 發(fā)光工作液/cm2 膜)中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育 2 分鐘，準(zhǔn)備立即壓片 曝光。孵育時間過長不會增加靈敏度，有時還會導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促 反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進(jìn)行，也會導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。 為達(dá)節(jié)約目的可將 膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。
4. 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。
5. 打開 X 光膠片暗盒，在暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將 Western Blot 膜貼在 保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹 Western Blot 膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余 的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋 Western Blot 膜的保鮮膜固定在暗 盒內(nèi)，蛋白帶面向上。
6. 暗房內(nèi)壓 X 光膠片，分別曝光不同的時間如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。
【注意事項】
1. 步驟 1～5 可在日光燈下操作;但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時間過久靈敏度可能略有降低，移 到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
2. 長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶 模糊。
3. 發(fā)光工作液孵育約 2 分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋 白條帶 發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使 X 光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā) 光時間。肉眼不可見的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時并使 X 光膠片感光，因而弱帶可曝光 1-10 小 時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用 ECL 發(fā)光和 曝光。
4. 由于超敏發(fā)光液極其靈敏，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗 1:1000～1:4000， 二抗 1:2000～1:5000?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失敗。
5. 某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。
6. 使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白 Marker 和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶 的位置和大小。
7. NaN3能抑制 HRP 活性，回收第二抗體應(yīng)避免使用 NaN3，如必需使用勿超過 0.01%。
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