純化得到至多10 mg的無(wú)內(nèi)毒素高轉(zhuǎn)染級(jí)純質(zhì)?；蚩滤官|(zhì)粒DNA

上海金畔生物科技有限公司提供凱杰Qiagen 去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) 12362/12381/12391，品質(zhì)保證，價(jià)格優(yōu)惠，全國(guó)聯(lián)保，歡迎咨詢。

純化得到的DNA內(nèi)毒素水平低于0.1 EU/μg

純化流程快，同時(shí)去除內(nèi)毒素

獲得高產(chǎn)量、高拷貝質(zhì)粒DNA

使用LyseBlue，獲得最佳的裂解和高產(chǎn)量的DNA

EndoFree Plasmid Kits基于陰離子交換技術(shù)，可快速制備不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。QIAfilter Cartridges過(guò)濾快速澄清裂解液。制備的DNA純度超過(guò)兩次CsCl梯度離心法所得DNA的純度，適合超轉(zhuǎn)染級(jí)純的應(yīng)用。EndoFree Plasmid Buffer Set可用于制備10次mega規(guī)?；?次giga規(guī)模轉(zhuǎn)染級(jí)純質(zhì)?；蚩扑官|(zhì)粒DNA制備。

Performance

EndoFree Plasmid Kit將高效的內(nèi)毒素去除步驟整合到質(zhì)粒純化流程中，不需要額外步驟，也不需用親和柱去除脂多糖。通過(guò)QIAfilter Mega-Giga Cartridge過(guò)濾細(xì)菌裂解液，并使用重力流QIAGEN-tip陰離子交換柱純化質(zhì)粒DNA。產(chǎn)量可達(dá)10 mg（Giga）、2.5 mg（Mega）、500 μg（Maxi）DNA。純化的DNA無(wú)內(nèi)毒素（<0.1 EU/μg DNA）。

選用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit純化低拷貝質(zhì)粒和科斯質(zhì)粒，將會(huì)得到更好的效果，因?yàn)楹笳咝枰^大的培養(yǎng)體積，而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。

EndoFree Plasmid Kits去除細(xì)菌在裂解過(guò)程中釋放的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素會(huì)影響原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染。從EndoFree Plasmid Kits得到的無(wú)內(nèi)毒素DNA高度適用于可重復(fù)且結(jié)果可靠的轉(zhuǎn)染（參見(jiàn)”Plasmid purification method versus transfection efficiency”和”Plasmid purity versus transfection efficiency”及表”Endotoxin levels in plasmid preparations”和”EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells”）。QIAGEN超純無(wú)內(nèi)毒素DNA也適用于基因治療研究和其他敏感應(yīng)用。

質(zhì)粒制備中的內(nèi)毒素水平*

* 宿主菌：大腸桿菌DH5α? 質(zhì)粒：pRSVcat。

? 1? ng LPS = 1.8 EU。

? 根據(jù)表中數(shù)據(jù)計(jì)算 。

無(wú)內(nèi)毒素DNA轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞的高轉(zhuǎn)染率*

* 原代兔胃壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2（CLONTECH），pEGFP-N2由所示的方法制備。使用Effectene Transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染。該數(shù)據(jù)是細(xì)胞表達(dá)GFP的百分率，由轉(zhuǎn)染48小時(shí)后綠色熒光細(xì)胞數(shù)量確定。轉(zhuǎn)染效率是每種純化方法制備的超過(guò)2個(gè)不同的DNA中6–9個(gè)復(fù)制樣本的平均值。（數(shù)據(jù)由C. Chew and J. Parente提供，Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.）

Principle

純化的質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素污染水平取決于所用的純化方法（參見(jiàn)”Endotoxin levels in plasmid preparations”）。硅膠技術(shù)純化的DNA具有非常高的內(nèi)毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對(duì)低水平內(nèi)毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內(nèi)毒素去除步驟，獲得<0.1 EU/μg的質(zhì)粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設(shè)計(jì)的過(guò)濾裝置，用于代替細(xì)菌細(xì)胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀，清除細(xì)菌裂解液，相比離心可大量節(jié)約時(shí)間，減少1小時(shí)的質(zhì)粒純化時(shí)間。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用內(nèi)部真空方式輕松高效的清除大量細(xì)菌裂解液（注意：該試劑盒不包含瓶子）。

QIAGEN-tips中獨(dú)特的陰離子交換樹脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）專為核酸純化而開發(fā)。它卓越的分離性能使得DNA純度與連續(xù)兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當(dāng)。由重力流驅(qū)動(dòng)并持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的預(yù)裝QIAGEN-tips，最大限度減少手動(dòng)制備質(zhì)粒所需的時(shí)間。整個(gè)QIAGEN質(zhì)粒純化系統(tǒng)不使用有毒物質(zhì)，如苯酚，氯仿，溴化乙錠和CsCl，最大限度地減少對(duì)用戶和環(huán)境的危害。

內(nèi)毒素，又稱脂多糖或LPS，是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的組成部分，如大腸桿菌（參見(jiàn)”Bacterial cell wall”）。內(nèi)毒素在質(zhì)粒裂解純化過(guò)程中釋放出來(lái)，并顯著降低內(nèi)毒素敏感細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率。此外，內(nèi)毒素與DNA競(jìng)爭(zhēng)“自由”轉(zhuǎn)染試劑，影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒DNA的攝取。內(nèi)毒素也誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)生非特異性免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染結(jié)果的誤讀。這些反應(yīng)包括誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和脂類，如IL-1和前列腺素等的合成?？傮w而言，內(nèi)毒素在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中是不可控變量，影響結(jié)果的可重復(fù)性，使它們難以對(duì)比、解讀。在基因治療研究中，內(nèi)毒素可造成內(nèi)毒素休克綜合癥和激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，干擾研究。

Procedure

在堿性條件下，細(xì)菌細(xì)胞裂解，使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過(guò)濾后的裂解液中。冰浴后，將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上，在適當(dāng)?shù)牡望}和pH條件下，質(zhì)粒DNA選擇性結(jié)合。用中鹽緩沖液清除RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他低分子量雜質(zhì)，超純質(zhì)粒DNA被高鹽緩沖液洗脫（參見(jiàn)”QIAGEN Plasmid Kit procedures”）。最后DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。

Applications

使用EndoFree Plasmid Kits純化的DNA適合多種敏感應(yīng)用，包括：

轉(zhuǎn)染，包括原代、敏感以及懸浮細(xì)胞

基因治療研究

基因沉默

顯微注射