SYBR? Green qPCR Mix (with ROX)
Cat. #：P2091a，P2092a，P2093a
產(chǎn)品簡介
SYBR? Green qPCR Mix是2X濃縮的實時定量PCR預混液，使用時只需加入模板和引物即可進行反應。采用創(chuàng)新的熱啟動機制可以減少引物二聚體和其他次級產(chǎn)物對反應的干擾，可以顯著提高定量PCR的特異性、擴增效率，得到更廣的可定量擴增區(qū)域。采用了新的增強劑，對各種目的片段 PCR 效率的波動可控制在最小范圍內(nèi)，反復凍融對擴增性能影響極小。本品配有進口參比染料ROX，適用于需要ROX校正的定量PCR機型，如ABI等。
產(chǎn)品組成
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Component
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P2091a
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P2092a
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P2093a
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2X SYBR? Green qPCR Mixa
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1 ml
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1 ml × 5
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1 ml × 10
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100X ROX Reference Dye*
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40 μl
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200 μl
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400 μl
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超純水
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1 ml
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1 ml × 5
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–
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a 包含SYBR? Green I，Hotstart Taq DNA聚合酶，Aptamer，dNTP及反應緩沖液等。
* 所配ROX含量為最終反應體系的2%，請根據(jù)需要調整用量。
保存條件
SYBR? Green qPCR Mix -20℃避光保存2年，4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可長期保存。
質量控制
純度檢測：經(jīng)質量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能檢測：經(jīng)不同來源的模板和引物檢測，產(chǎn)品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復性等。
應用舉例
1. 配制反應體系
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Component
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Volume
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Final concentration
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DNA template[1]
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0.5-2 μl
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1-4 μl
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Variable
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Forward primer (10 μM)[2]
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0.2 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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Reverse primer (10 μM)
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0.2 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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2X SYBR? Green qPCR Mix[3]
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5 μl
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10 μl
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1X
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100X ROX Reference Dye[4]
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Variable
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Variable
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Variable
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ddH2O
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Variable
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Variable
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–
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Total volume[5]
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10 μl
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20 μl
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–
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[1] DNA模板建議用量（10-20 μl體系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小，以免造成較大的誤差，但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度（加樣前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。
[2] 引物終濃度建議范圍：0.2-0.6 μM。特異性差時可降低濃度，效率低時可提高濃度。
[3] 如果熔解曲線出現(xiàn)雜峰，可以減少Mix用量至8 μl（20 μl體系）；如果對痕量模板的檢出率較低，可以增加Mix用量至12 μl（20 μl體系）。
[4] 對于某些固定型號的儀器，需要添加ROX才能精確測定Ct值。ROX會給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此，為了避免ROX的雜峰背景干擾，在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項，然后再進行數(shù)據(jù)的收集與分析。由于ROX的使用體積較小，建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明，下表僅供參考。
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Instruments
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ROX (100X)
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ABI PRISM 7000/ PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700
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1-2% (High ROX)
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ABI 7500/ 7500 Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/ Mx4000
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0.2% (Low ROX)
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Bio-Rad CFX96/ CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96; Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler
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No ROX
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[5] 建議總體積不小于10 μl，以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。
2. 設定反應程序進行qPCR反應
注：本品含有熱啟動酶，在60℃時會抑制酶活性，因此不建議使用兩步法，推薦使用經(jīng)典三步法或極速三步法。
經(jīng)典三步法程序示例如下：
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Stage
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Temperature
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Time
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Cycle
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Initial denaturation
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94℃
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3 min
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1
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Denaturation
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94℃
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15 sec
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40
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Annealing
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55-65℃[1]
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15 sec
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Extension
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72℃
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20 sec
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Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]
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本品可用極速三步法快速完成反應，程序示例如下：
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Stage
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Temperature
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Time
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Cycle
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Initial denaturation
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94℃
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3 min
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1
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Denaturation
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94℃
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5 sec
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40
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Annealing
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55-65℃[1]
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5 sec
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Extension
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72℃
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5-10 sec[2]
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Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]
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[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，則以Tm值為退火溫度，一般不低于55℃。
[2] 150 bp以內(nèi)的擴增子可設置為5 sec；150-300 bp的擴增子可設置為10 sec；300 bp以上的擴增子可適當延長時間。
[3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同，一般按儀器默認熔解曲線采集程序即可?？稍谘由欤ㄈ椒ǎ┗蛲嘶鹧由欤▋刹椒ǎ╇A段采集信號，也可在反應結束后72 hrs之內(nèi)采集（避光低溫保存）。
3. 分析結果
觀察擴增曲線；調整基線，計算Ct值；觀察熔解曲線檢測特異性；進行相對或絕對定量。
注意事項
? 使用前Mix需要完全解凍，充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可避光保存于4℃。
? 將（n+x）份反應液混勻后再分注到n個單管中，可降低加樣誤差。（n為重復次數(shù)，x為損耗量，一般為n的1/10）
? ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異，Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。
? 輕輕混勻反應液，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會干擾熒光檢測。可瞬時離心去除氣泡。
? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物，隨實驗結果適當調整引物用量（0.05-0.9 μM）——特異性較差時減少引物用量，或以3℃為增量提高退火溫度，擴增效率較低時增加引物用量。
? DNA模板的量應小于500 ng/反應，過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據(jù)模板類型與基因表達量適當調整用量。
? 熔解曲線的采集不是必須的，初次使用的引物建議進行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產(chǎn)物的特異性。產(chǎn)物特異性不好的原因有：引物特異性低；退火溫度設置偏低；引物/模板濃度偏高；等。同時，建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的特異性。
